عزل الخلايا الجذعية للورم الميلانيني: طريقة للحصول على خلايا الورم الميلانيني الإيجابية والسالبة CD133 باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا

الملخص

المصدر: Welte، Y. et al. زراعة الخلايا المشتقة من المريض وعزل الخلايا الجذعية السرطانية المفترضة CD133 + من سرطان الجلد. J. Vis. Exp. (2013)

يصف هذا الفيديو تقنية عزل الخلايا الجذعية للورم الميلانيني السلبي والإيجابي CD133 من خط خلايا الورم الميلانيني الأولي باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا. تمت دراسة CSCs الورم الميلانيني الإيجابي CD133 لفهم آليات تكوين أورام الورم الميلانيني.

البروتوكول

فئة

1. فرز الخلايا المغناطيسية لخلايا CD133 ⁺ و CD133^- خلايا الورم الميلانيني باستخدام أعمدة LS

1. قم بإعداد المخزن المؤقت MACS الذي يحتوي على 2 ملي مولار EDTA و 5٪ FCS في PBS. امزج عن طريق المخزن المؤقت المقلوب والترشيح المعقم باستخدام وحدة تصفية Steritop-GP 0.22 ميكرومتر. يبرد المخزن المؤقت إلى 4-8 درجة مئوية ويزيل الغاز قبل الاستخدام.
2. قم بتسخين Accutase و PBS و Quantum 263 مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
3. اغسل 80٪ من الخلايا المتجمعة باستخدام PBS. أضف كمية مناسبة من Accutase واحتضانها حتى تنفصل الخلايا عن سطح المزرعة. اجمع الخلايا في أنبوب سعة 50 مل باستخدام وسط Quantum 263.
4. حدد رقم الخلية وجهاز الطرد المركزي العدد المطلوب من الخلايا لمدة 5 دقائق عند 300 × جم و 4-8 درجة مئوية. (وفقا لبروتوكول Miltenyi ، يمكن تحميل 2 × 10⁹ خلايا كحد أقصى لكل عمود LS. يجب تحديد الأرقام المثلى الخاصة بخط الخلية ويمكن أن تكون أقل بكثير.) شفط طافي تماما.
5. قم بإعادة تعليق 1 × 10⁸ خلايا كحد أقصى مع مخزن مؤقت MACS سعة 350 ميكرولتر (لأرقام الخلايا الأعلى ، قم بتوسيع نطاق جميع المخزن المؤقت MACS التالي ، وكاشف حجب FcR ، و CD133 / 1-Biotin ، وأحجام MicroBeads المضادة للبيوتين وفقا لذلك).
6. أضف 100 ميكرولتر كاشف حجب FCR.
7. أضف 50 ميكرولتر CD133 / 1-Biotin. تخلط جيدا باستخدام دوامة وتحتضن عند 4-8 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
8. اغسل الخلايا بإضافة 10 مل من المخزن المؤقت MACS وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم و 4-8 درجات مئوية.
9. كرر خطوة الغسيل (1.8).
10. أعد تعليق حبيبات الخلية مع 400 ميكرولتر MACS عازلة.
11. أضف 100 ميكرولتر من الميكروبيدات المضادة للبيوتين. تخلط جيدا باستخدام دوامة وتحتضن عند 4-8 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
12. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد فاصل MACS للفصل المغناطيسي. قم بتوصيل QuadroMACS بحامل MACS Separator Multi. أدخل العدد المطلوب من أعمدة LS مع أجنحة العمود في المقدمة في المجال المغناطيسي ل QuadroMACS. ضع مرشح ما قبل الفصل (مع شبكة نايلون 30 ميكرومتر) في كل عمود LS وأنبوب تجميع مناسب (15 مل أو 50 مل) أسفل كل عمود. قم بإعداد الفلتر والعمود عن طريق الشطف باستخدام مخزن MACS سعة 3 مل. تجاهل التدفق.
13. اغسل الخلايا بإضافة 10 مل من المخزن المؤقت MACS وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم و 4-8 درجات مئوية.
14. قم بإعادة تعليق الخلايا ذات المخزن المؤقت MACS سعة 500 ميكرولتر وقم بتطبيق تعليق الخلية على عمود LS باستخدام مرشح الفصل المسبق.
15. اغسل ثلاث مرات باستخدام 3 مل من المخزن المؤقت MACS لكل عمود. أضف المخزن المؤقت الجديد فقط عندما يكون خزان العمود فارغا.
يحتوي
16. إجمالي النفايات السائلة التي تم جمعها على جزء خلية CD133 غير المسمى.
17. تخلص من مرشح الفصل المسبق ، وقم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب تجميع مناسب.
18. قم بتطبيق 5 مل من MACS buffer. اغسل على الفور خلايا CD133 ⁺ المسمى عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود.
19. لزيادة نقاء الكسر السالب ، قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود LS متوازن جديد يتم إدخاله في QuadroMACS. تحتوي النفايات السائلة على جزء CD133.
20. تجاهل الأعمدة.

المواد