الاستزراع السريع للخلايا الصباغية الأولية والخلايا الليفية في الفئران: عزل الخلايا الصباغية والخلايا الليفية من عينة جلد الفئران الكاملة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Murphy ، B. M. et al. التوليد السريع للخلايا الصباغية الأولية للفئران ومزارع الخلايا الليفية. J. Vis. Exp. (2019)

يصف هذا الفيديو الطريقة السريعة لعزل واستزراع الخلايا الصباغية والخلايا الليفية في وقت واحد من جلد جرو الفأر بعد الولادة. يمكن الحفاظ على هذه الخلايا ومعالجتها في المختبر لدراسة بيولوجيا خلايا الجلد والتئام الجروح والورم الميلانيني.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل الخلايا الصباغية والخلايا الليفية

1. قتل الذكور و / أو الإناث C57BL / 6J من الذكور و / أو الإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 0 و 4 أيام عن طريق قطع الرأس ، وإزالة الأطراف من الفئران التي تم القتل رحيمة باستخدام مقص جراحي.
2. في خزانة التدفق الصفحي ، قم بلف جذع كل فأر لفترة وجيزة في طبق بتري معقم يحتوي على 70٪ من الإيثانول. قم بإزالة الجذع من الإيثانول وضعه في طبق بتري فارغ ومعقم.
3. باستخدام المقص الجراحي ، المعقم في 70٪ من الإيثانول ، قم بعمل شق في الجلد على الجانب البطني من الجذع بدءا من الرقبة إلى الذيل. قشر الجلد من جذع الفأر باستخدام ملقط معقم.
4. ضعي الجلد ، بحيث يكون جانب الأدمة لأسفل ، في طبق مكون من 6 آبار يحتوي على 3 مل من محلول 1x مضاد حيوي / مضاد للفطريات واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
5. قم بتشغيل مفرمة المناديل مع الإعدادات التالية في مكانها: سمك الشريحة: 1 ميكرومتر ؛ قوة الشفرة: ~ 60٪ من الحد الأقصى ؛ السرعة: ~ 50٪ من الحد الأقصى.
6. انقل الجلد ، جانب الأدمة لأسفل ، إلى قرص مفرمة الأنسجة المعقم وقم بتمرير الجلد بالكامل عبر مفرمة الأنسجة المنشطة 3 مرات.
7. انقل الجلد المتجانس إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل يحتوي على 3 مل من محلول هضم الجلد (تحضير 3 مل من محلول هضم الجلد الطازج الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين ، 1٪ محلول بنسلين / ستربتومايسين ، 1٪ ل-جلوتامين ، 10 مجم / مل كولاجيناز من النوع الأول ، 0.25٪ تربسين خنزير و 0.02 مجم / مل ديوكسيربونوكلياز I في RPMI 1640). امزج التعليق الناتج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10-15 مرة باستخدام ماصة دقيقة P1000.
8. قم بتغطية الأنبوب المخروطي واحتضان العينة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، مع قلب الأنبوب كل 3-5 دقائق.
9. حبيبات الخلايا في الجلد متجانسة عن طريق الطرد المركزي للأنبوب المخروطي في دوار دلو متأرجح عند 750 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
10. باستخدام ماصة دقيقة P1000 ، قم بإزالة المخزن المؤقت لهضم الجلد ببطء وبشكل كامل ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات.
    ملاحظه: يمكن حفظ جزء من الجلد بالكامل في هذه المرحلة واستخدامه كعنصر تحكم لتأكيد نقاء الخلايا. قم بتصفية هذه الخلايا من خلال مصفاة خلوية 70 ميكرومتر وإجراء مزيد من العملية.
11. أعد تعليق حبيبات الخلية تماما في 1 مل من وسائط الخلايا الصباغية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 15-20 مرة باستخدام ماصة دقيقة P1000. أضف محلول الخلية الناتج بالتنقيط إلى بئر غير مغلف من طبق مكون من 6 آبار يحتوي على 1 مل من وسائط الخلايا الصباغية.
12. ضع الجلد المطلي متجانسا في حاضنة زراعة الأنسجة على درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. اسمح للثقافات بالحضانة لمدة 40 دقيقة
    ملاحظه: خلال هذا الوقت ، تلتصق بعض الخلايا الليفية في الجلد المتجانسة بالطبق غير المطلي بينما تظل الخلايا الصباغية والخلايا الكيراتينية معلقة.
13. انقل المادة الطافية المزروعة من الطبق غير المطلي إلى بئر واحد من طبق 6 آبار مغسول مسبقا ومغطى بالكولاجين. أضف G418 إلى الوسائط بحيث يكون التركيز النهائي 100 نانوغرام / مل.
14. أضف 2 مل من وسائط الخلايا الليفية إلى بئر واحد من الطبق غير المطلي ، والذي يحتوي الآن على الخلايا الليفية الملتصقة.
15. احتضان كلتا المزرعتين طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
16. استنشق الوسائط وأي حطام من كل ثقافة بشكل منفصل ، بعد 16-24 ساعة من الطلاء. اغسل كل طبق مرتين باستخدام 1 مل من PBS المعقم ، ثم أضف 2 مل من وسائط الخلايا الصباغية الطازجة بالإضافة إلى 100 نانوغرام / مل G418 إلى ثقافة الخلايا الصباغية و 2 مل من وسائط الخلايا الليفية الطازجة إلى ثقافة الخلايا الليفية. (تحضير 6 مل من وسائط الخلايا الصباغية الطازجة التي تحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين ، و 7٪ مصل حصان ، و 1٪ بنسلين / محلول ستربتومايسين ، و 1٪ ل-جلوتامين ، و 0.5 ملي مولار ثنائي بوتيريل AMP دوري (dbcAMP) ، و 20 نانومتر تيترادكانويلفوربول 13-أسيتات (TPA) و 200 جزء من توكسين الكوليرا (CT) في وسائط المغذيات F-12 Ham.
    ملاحظة: يمكن تصنيع حلول مخزون dbcAMP و TPA و CT المركزة وتخزينها لمدة عام > عند -80 درجة مئوية. يمكن تخزين الوسائط الأساسية التي تفتقر إلى هذه المكونات لمدة تصل إلى شهر واحد عند 4 درجات مئوية
    تحضير 4 مل من أوساط الخلايا الليفية التي تحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين و 1٪ ل-جلوتامين في وسط النسر المعدل من دولبيكو. يمكن تخزين هذه الوسائط عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد)
17. بعد معالجة مزارع الخلايا الصباغية ب G418 لمدة 48 ساعة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من PBS المعقم وأضف 2 مل من وسائط الخلايا الصباغية الطازجة بدون G418 إلى الثقافة.
    ملاحظه: مع استمرار موت الخلايا الليفية في ثقافة الخلايا الصباغية بعد العلاج G418 ، اغسل الطبق باستخدام PBS معقم لإزالة الخلايا الميتة وإضافة وسائط الخلايا الصباغية الطازجة. يجب تمرير مزارع الخلايا الصباغية والخلايا الليفية عندما تصل إلى 70-80٪ من التقاء.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الإيثانول ، 200 دليل فيشر ساينتيك 22032601 محلول مضاد للفطريات مضاد للمضادات الحيوية (100x) سيجما ألدريتش أ 5955 ماكلوين مروحية مناديل تيد بيلا 10180 شفرة مفرمة المناديل تيد بيلا 121-6 قرص بلاستيك مفرمة الأنسجة تيد بيلا 10180-01 الكولاجيناز النوع الأول ورثينجتون للكيماويات الحيوية LS004156 لحم الخنزير التربسين سيجما ألدريتش 85450 ج التربسين VWR VWRL0154-0100 G418 ثاني كبريتيد P212121 LGB-418-1 وسط النسر المعدل من Dulbecco جيبكو 12800-082 وسائط RPMI 1640 سيجما ألدريتش R8758 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco سيجما ألدريتش د8537 طبق ثقافة الخلايا 6 بئر سيجما ألدريتش SIAL0516 5 مل أنابيب البوليسترين المستديرة القاع فيشر ساينتيك 352008 طبق زراعة الخلايا 10 سم كورنينج 430167 ألبومين مصل الأبقار فيشر ساينتيك ص9706-100 مصل الأبقار الجنينية سيجما ألدريتش 12306 ج محلول كورنينج البنسلين / الستربتومايسين فيشر ساينتيك 30-002-CL مزيج المغذيات F-12 هام وسائل الإعلام سيجما ألدريتش N6760 الكولاجين من ذيل الفئران سيجما ألدريتش [ك7661] 0.2 ميكرومتر PES مرشح حقنة معقمة VWR هاتف: 28145-501 مصفاة خلية 40 ميكرومتر فيشر ساينتيك 22363547 مصفاة خلية 70 ميكرومتر فيشر ساينتيك 22363548 توكسين الكوليرا سيجما ألدريتش [ك8052] [ك] مصل الحصان فيشر ساينتيك 26050088 هيكلون ل-جلوتامين فيشر ساينتيك SH3003402