تحضير فيريون فيروس ورم خلية ميركل المؤتلف (MCPyV): تقنية لإنتاج فيريون MCPyV المؤتلف عالي العيار

الملخص

المصدر: Wei Liu et al. عدوى فيروس ورم خلية ميركل واكتشافها ، J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نعرض تحضير فيروس ورم متعدد خلايا ميركل أو فيريونات MCPyV باستخدام خلايا 273TTT. تساعد هذه التقنية على إنتاج عيار عال من فيريونات MCPyV المؤتلفة.

البروتوكول

فئة

1. تحضير فيريون MCPyV المؤتلف

1. هضم 50 ميكروغرام من بلازميد pR17b (الذي يحمل جينوم MCPyV) مع 250 وحدة من BamHI-HF بحجم 200 ميكرولتر (4 ساعات عند 37 درجة مئوية) لفصل الجينوم الفيروسي عن العمود الفقري للناقل (الشكل 1).
2. أضف 1200 ميكرولتر من PB المخزن المؤقت (مكمل ب 10 ميكرولتر من 3 M NaAc ، درجة الحموضة 5.2) إلى الحمض النووي المهضوم وتنقية أكثر من 2 عمود دوران صغير (سعة 20 ميكروغرام من الحمض النووي). قم بإزالة البلازميد pR17b المهضوم من كل عمود ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (10 ملي مولار Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 1 ملي مولار EDTA).
3. قم بإعداد تفاعل الربط في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. أضف 400 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد المنقى من الخطوة 1.2 ، و 8.6 مل من 1.05x T4 ligase المؤقت و 6 ميكرولتر من T4 ligase عالي التركيز. احتضن عند 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
4. أضف 45 مل من PB المخزن المؤقت (مكمل ب 10 ميكرولتر من 3 M NaAc ، الرقم الهيدروجيني 5.2) إلى الربط واستخدم مشعب فراغ للتحميل من خلال عمودين تدور صغيرين. قم بتخطيب كل عمود ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. توقع إنتاجا يبلغ حوالي 30 ميكروغرام من الحمض النووي.
5. في وقت متأخر من بعد الظهر / المساء ، قم بزرع خلايا 6 × 10⁶ 293TT في طبق 10 سم يحتوي على وسط DMEM مكمل بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ ، و 1٪ أحماض أمينية غير أساسية ، و 1٪ L-glutamine بدون هيجروميسين B.
6. في صباح اليوم التالي ، تأكد من أن الخلايا ملتقية بنسبة 50٪. Transfect باستخدام 66 ميكرولتر من كاشف التعدي (1.1 ميكرولتر / سم²) ، 12 ميكروغرام من الحمض النووي المعزول MCPyV المعاد ربطه من الخطوة 1.4 ، 8.4 ميكروغرام من البلازميد تعبير ST pMtB و 9.6 ميكروغرام من بلازميد تعبير LT pADL.
7. عندما تكون الخلايا المنقولة ملتقية تقريبا ، في اليوم التالي ، قم بتربسين الخلايا ونقلها إلى طبق 15 سم للتوسع المستمر.
8. اختياريا ، خذ عددا صغيرا من خلايا 293TT عند التمدد وقم بإجراء تلطيخ IF ل MCPyV LT (CM2B4) و VP1 (أرنب MCV VP1) لتحديد كفاءة التعداد. في هذه المرحلة ، قد تكون إشارات LT النووية مرئية ، ولكن من المحتمل ألا يكون تعبير VP1 قابلا للاكتشاف.
9. عندما يصبح الطبق مقاس 15 سم ملتقى تقريبا (عادة بعد 5-6 أيام من التعداء الأولي) ، انقل الخلايا إلى ثلاثة أطباق مقاس 15 سم. احصد الخلايا من الأطباق التي يبلغ طولها 15 سم عندما تصبح شبه متقاربة واتبع بروتوكول حصاد الفيروس أدناه.
   ملاحظه: اختياريا إجراء مراقبة الجودة IF كما هو موضح في الخطوة 1.8. يجب أن تكون معظم الخلايا إيجابية MCPyV LT و VP1 في هذه المرحلة.
10. لحصاد الفيروس ، قم بتربسين الخلايا ، وتدور عند 180 × جم لمدة 5 دقائق في RT وقم بإزالة المادة الطافية. أضف حجم حبيبات خلية واحدة من DPBS-Mg (DPBS مع 9.5 ملي مولار MgCl₂ و 1x مضاد حيوي مضاد للفطريات). بعد ذلك ، أضف 25 ملي مولار من كبريتات الأمونيوم (من محلول مخزون 1 M pH 9) متبوعا بنسبة 0.5٪ Triton X-100 (من محلول مخزون بنسبة 10٪) ، و 0.1٪ بنزوناز ، و 0.1٪ من DNase المعتمد على ATP. تخلط جيدا وتحتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
11. احتضن الخليط لمدة 15 دقيقة على الثلج ثم أضف 0.17 حجم من 5M NaCl. اخلطي واحتضنيه على الثلج لمدة 15 دقيقة أخرى. تدور لمدة 10 دقائق عند 12,000 × جم في جهاز طرد مركزي 4 درجات مئوية. إذا لم يكن المادة الطافية واضحة ، فقم بقلب الأنبوب برفق وكرر خطوة الدوران. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
12. أعد تعليق الحبيبات باستخدام حجم واحد من DPBS مكملا ب 0.8 M كلوريد الصوديوم ، ثم قم بالتدوير مرة أخرى ، كما هو موضح في الخطوة 1.11.
13. اجمع بين المواد الطافية من الخطوتين 1.11 و 1.12 ، وقم بالدوران مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 1.11.
14. صب تدرجات من اليوديكسانول في جدار رقيق 5 مل أنابيب بولي ألومير عن طريق الأساس (27٪ ، ثم 33٪ ، ثم 39٪) ~ 0.7 مل خطوات باستخدام حقنة 3 مل مزودة بإبرة طويلة أو ماصة p1000.
15. قم بتحميل 3 مل من المادة الطافية المصفاة المحتوية على الفيروسات على تدرج اليوديكسانول المحضر.
16. يدور لمدة 3.5 ساعة عند 234,000 × جم و 16 درجة مئوية في دوار SW55ti. اضبط التسارع والتباطؤ على البطيء.
17. بعد الطرد المركزي الفائق ، اجمع 12 كسرا في أنابيب السيليكون (كل جزء ~ 400 ميكرولتر).
18. تحليل الكسور لوجود الفيروس بواسطة كاشف dsDNA و / أو اللطخة الغربية ل VP1 (أرنب MCV VP1). تجمع الكسور المتدرجة مع ذروة محتوى dsDNA و / أو VP1 وتوصيف المخزون بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لحساب مكافئ الجينوم الفيروسي. قم بتخزين مرق فيريون MCPyV عند -80 درجة مئوية.

النتائج

الشكل 1. إنتاج فيريون MCPyV باستخدام الجينوم الفيروسي المؤتلف.(أ) خريطة البلازميد ل pR17b (بلازميد جينوم MCPyV). (ب) صورة تمثيلية لعينة فيريون MCPyV تم حصادها وتنقيتها على تدرج. يشير السهم إلى نطاق فيريونات MCPyV المركزة في قلب التدرج. (ج) تم قياس رقم نسخة الجينوم الفيروسي في كل جزء متدرج باستخدام qPCR. يشار إلى كسور التدرج الأساسية (الأرقام ، العد م...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM / F12 متوسط ثيرمو فيشر العلمي 11330-032 بروتين EGF البشري المؤتلف ، CF أنظمة البحث والتطوير 236-ال إم -200 يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية CHIR99021 كايمان للكيماويات 13122 [1] يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية CHIR99021 سيغما SML1046 يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية الكولاجيناز النوع الرابع ثيرمو فيشر العلمي 17104019 Dispase II روش 4942078001 مضاد حيوي - مضاد للفطريات ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 15240-062 الحماية من الضوء DMEM وسيط ثيرمو فيشر العلمي 11965084 بارافورمالدهيد سيغما ص 6148 مضاد MCPyV LT (CM2B4) سانتا كروز SC-136172 الكثير # B2717 أرنب MCV VP1 مصل الأرنب متعدد النسيلة #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm