تصور تعبير البروتين القائم على CUBIC : إجراء لتصور تعبير البروتين في خزعات جلد الفأر ذات السماكة الكاملة

الملخص

المصدر: Liang, H. et al. يصور بروتوكول CUBIC تعبير البروتين بدقة خلية واحدة في مستحضرات الجلد الكاملة. J. Vis. Exp (2016)

يصف هذا الفيديو تقنية التصور المستندة إلى CUBIC ، وهي تقنية تصوير تعتمد على تطهير الأنسجة للتقييم البصري للتعبير عن البروتين في خزعات الجلد الكاملة بدقة خلية واحدة في 3D. يسمح هذا البروتوكول البسيط تقنيا بتصور بروتينات الجلد دون تحضير أقسام الجلد.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير أنسجة جلد الفأر الشفافة

ملاحظة: كانت جميع الفئران المستخدمة في هذه الدراسة على خلفية وراثية C57BL / 6

1. مجموعة من أنسجة جلد الفأر.
   1. قتل الفئران بشكل إنساني عن طريق خلع عنق الرحم.
   2. قم بإزالة الشعر بعناية من منطقة الجلد ذات الصلة باستخدام أداة تشذيب مع الحرص على عدم جرح الجلد.
   3. اغسل الجلد لتطهيره بنسبة 70٪ من الإيثانول في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
   4. ارفع جلد الرقبة الظهرية بالملقط وقم بعمل شق بالمقص.
   5. تشريح مساحة كبيرة من جلد الفأر الظهري (حوالي 1.5 × 4 سم).
   قم
   6. بتسطيح الجلد ، بحيث يكون جانب الأدمة لأسفل ، على ورق ترشيح وقم بتدوين الاتجاه الأمامي الخلفي للعينة.
   7. قم بقص ورق الترشيح حول الجلد المقطوع ، وضعه في أنبوب سعة 15 مل مملوء بمحلول بارافورمالدهيد (PFA) المحضر حديثا بنسبة 4٪ في PBS.
   8. ثبت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، أو طوال الليل في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.
   9. اغسل الجلد 2 × 5 دقائق في PBS في أنبوب سعة 15 مل.
      ملاحظه: فيما يلي (1.1.10 - 1.1.12) هي خطوات اختيارية لتخزين الأنسجة على المدى الطويل.
   10. تجفيف الجلد المقطوع في PBS مع زيادة تركيز الإيثانول (25٪ ، 50٪ ، 70٪) في أنبوب سعة 15 مل خلال خطوات الغسيل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
   11. قم بتخزين البشرة الجافة في 70٪ من الإيثانول في PBS في أنبوب 15 مل عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.
   12. قبل أربع ساعات من التنظيف، أعد ترطيب أنسجة الجلد في PBS مع انخفاض تركيز الإيثانول (70٪، 50٪، 25٪، 0٪) في أنبوب سعة 15 مل خلال خطوات الغسيل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
2. مسح خزعات جلد الفأر
   1. قم بإعداد محلول المقاصة CUBIC1 عن طريق إذابة 3.85 جم من اليوريا و 3.85 جم من النيتروجين ، النيتروجين ، الشمال ، الإيثيلين ديامين (2-هيدروكسي بروبيل) في 5.38 مل من الماء المقطر على سخان مضبوطة على 60-70 درجة مئوية. استخدم أداة تقليب ساخنة.
   2. أضف 2.31 جم من البولي إيثيلين جلايكول أحادي p-isooctylphenyl ether / Triton X-100 إلى المحلول بمجرد أن يصبح صافيا ويبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
   3. قم بقص جلد الفأر بشفرة حلاقة حادة إلى خزعات بأبعاد تقريبية 0.2 × 0.5 سم ، واغمرها في 5 مل من محلول المقاصة CUBIC1 في أنبوب سعة 15 مل. لتحسين تصور بصيلات الشعر ، تأكد من قطع الجانب الأطول من الخزعة على طول الاتجاه الأمامي الخلفي للعينة.
   4. ضعها على منصة دوارة في فرن تهجين على حرارة 37 درجة مئوية.
   5. قم بتغيير محلول المقاصة بعد 7 أيام. قم بإعداد محلول CUBIC1 الطازج قبل الاستخدام.
   6. تحقق من شفافية الأنسجة بعد 7 أيام. إذا لزم الأمر ، اترك الخزعات في محلول المقاصة CUBIC1 حتى تصبح الأنسجة شفافة تماما.
   7. بمجرد أن تصبح خزعة الجلد شفافة ، قم بإزالة محلول CUBIC1 ، وأضف 4 مل من 1x PBS لغسل الأنسجة 4 مرات لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية.
   8. اغسل أنسجة الجلد بنسبة 20٪ وزن / حجم من السكروز في PBS في أنبوب سعة 15 مل لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.
   9. قم بتجميد الأنسجة في وسط تركيب مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في أنبوب سعة 15 مل طوال الليل في فريزر -80 درجة مئوية.
      ملاحظه: ستزيد هذه الخطوة من نفاذية الخزعة لاختراق الأجسام المضادة في الخطوات اللاحقة.

فئة

2. تلطيخ التألق المناعي

1. قم بإذابة الأنسجة من (الخطوة 1.2.9) إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 ساعات.
2. اغسل المنديل في أنبوب 15 مل مع 5 مل من PBS لمدة 8 ساعات في درجة حرارة الغرفة لإزالة مركب OCT.
3. انقل الخزعات إلى أنبوب سعة 2 مل ، واحتضان الأنسجة في 1 مل من الأرانب المضادة للكيراتين 14 أو الأرانب المضادة ل Ki67 ، وكلاهما مخفف 1: 100 في PBST (PBS + 0.1٪ Triton-X100) لمدة 3 أيام على شاكر في فرن 37 درجة مئوية.
4. انقل الخزعات إلى أنبوب سعة 15 مل ، واغسل المنديل 4 مرات لمدة 6 ساعات في 5 مل من PBST على شاكر في فرن 37 درجة مئوية.
5. انقل الخزعات إلى أنبوب سعة 2 مل ، وأضف 1 مل من الجسم المضاد الثانوي Alexa594 المضاد للأرانب المخفف 1: 100 في PBST واحتضانه لمدة 3 أيام على شاكر في فرن 37 درجة مئوية.
6. انقل الخزعات إلى أنبوب سعة 15 مل ، واغسل المنديل 4 مرات لمدة 6 ساعات في 5 مل من PBST على شاكر في فرن 37 درجة مئوية.
7. انقل الخزعات إلى أنبوب سعة 2 مل ، وأضف 1 مل 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) محلول مضاد للبقع النووية (1: 1,000) في PBST واحتضانه طوال الليل على شاكر في فرن 37 درجة مئوية.
8. قم بإزالة محلول DAPI المضاد للتلطيخ ، وأضف 1 مل من PBST إلى أنبوب 2 مل لغسل المناديل 4 مرات لمدة 6 ساعات على شاكر في فرن 37 درجة مئوية.
   ملاحظه: خطوة اختيارية: يمكن تخزين الخزعات في الظلام في 1x PBS مع 0.02٪ أزيد الصوديوم لمدة 3 أسابيع على الأقل.

< p class = "jove_title" >3. التصوير

1. قم بإعداد محلول المقاصة CUBIC2 ، الذي يحتوي على 50٪ (وزن / حجم) من السكروز ، و 25٪ (وزن / حجم) اليوريا ، و 10٪ (وزن / حجم) 2،2 ′ '-nitrilotriethanol ، و 0.1٪ (حجم / حجم) Triton X-100.
2. احتضان أنسجة الجلد في محلول 1 مل CUBIC2 في أنبوب سعة 2 مل على شاكر لمدة 24 ساعة في فرن 37 درجة مئوية. هذه الخطوة سوف حتى معامل الانكسار للأنسجة.
3. تحقق من وضوح الأنسجة. بمجرد أن يصبح واضحا ، ضع خزعة الجلد بالكامل (0.2 × 0.5 سم) على جانبها الأطول على غطاء زجاجي ، بحيث يكون اتجاه طول بصيلات الشعر موازيا لسطح الغطاء (# 1 24 × 60 مم).
   ملاحظه: خطوة اختيارية: يمكن تخزين الخزعات الملطخة بالأجسام المضادة في محلول CUBIC2 لمدة 7 أيام تقريبا. لا يمكن تخزين الخزعات الملطخة باللون الأحمر النيلي إلا في محلول CUBIC2 لمدة تصل إلى يوم واحد ، ويجب تصويرها في أسرع وقت ممكن.
4. تحضير غرفة التصوير (الشكل 1).
   ملاحظة: المواد الاستهلاكية المطلوبة لإعداد غرفة التصوير هي: مسمار أزرق ، عجين اللعب أو ما شابه ذلك ، و 2 غطاء (24 × 50 مم) (الشكل 1 أ).
   1. قم بإعداد شريطين رفيعين من المسمار الأزرق (قطره حوالي 1 مم × 2 سم) ، وغطاءين (الشكل 1 ب).
   2. ضع شرائط زرقاء على زلة غطاء واحدة ، مما يتيح مساحة كافية لخزعة الجلد (الشكل 1 ج ، الخطوة 3.4.3).
   3. ضع خزعة الجلد بين الشرائط على الغطاء في قطرة من محلول CUBIC2 (الشكل 1C).
   4. قم بتغطية خزعة الجلد بالغطاء الثاني (الشكل 1 د).
5. ضع حجرة التصوير مع خزعة الجلد المثبتة على مرحلة المجهر متحد البؤر وانقل الأنسجة إلى مسار الضوء.
6. مسح العينة باستخدام مصدر ضوء الزئبق أو الهالوجين ومرشحات التألق القياسية (على سبيل المثال ، DAPI / GFP / CY3 / CY5) لتحديد المناطق ذات الأهمية الملطخة بالفلورسنت.
7. صور المناطق ذات الأهمية باستخدام هدف 10X و 20X (NA 0.75) وتقنيات التصوير المضان متحد البؤر القياسية (على سبيل المثال ، مع العينات الملونة DAPI تضيء بليزر 405 نانومتر وتجمع إشارة التألق بين 425-475 نانومتر ، ومع Alexa Fluor 594 أو Nile Red تضيء العينات بليزر 561 نانومتر وتجمع إشارة مضان بين 570-620 نانومتر).
8. قم بإنشاء مكدسات Z للصور لكل منطقة ذات أهمية باستخدام برنامج الحصول على الصور Z-stack المجهري (على سبيل المثال ، باستخدام برنامج تصوير عناصر NIS 4.13 كما هو موضح أدناه).
   1. تأكد من طاقة الليزر المثلى وحدد إعدادات PMT HV / Offset لجمع عينة من الفلورة.
   2. افتح شريط أدوات "اكتساب ND" من "عناصر التحكم في الاستحواذ".
   3. حدد علامة التبويب "إعداد السلسلة Z" (تأكد من إلغاء تحديد جميع علامات التبويب الأخرى).
   4. أثناء المسح المباشر ، ركز على الجزء العلوي من العينة واضغط على الزر "أعلى".
   5. ركز على الجزء السفلي من العينة واضغط على الزر "أسفل".
   6. إدخال حجم الخطوة المطلوب (أو اضغط على زر حجم الخطوة المحسن).
   7. اضغط على زر "تشغيل الآن".
   8. احفظ مكدسات Z الناتجة كمكدسات صور Tiff فردية (1 fluorochrome لكل صورة Z-stack).
9. استخدم مكدسات Z للصور لإعادة بناء مناطق الحجم ثلاثية الأبعاد ذات الأهمية باستخدام برنامج التحليل ثلاثي الأبعاد (على سبيل المثال ، باستخدام Imaris x64 7.2.3 كما هو موضح أدناه).
   1. ابدأ برنامج التحليل.
   2. اختر زر "تجاوز" في شريط الأدوات لإنشاء وحدة تخزين ثلاثية الأبعاد.
   3. افتح الصورة الملونة الأولى Z-stack (على سبيل المثال ، DAPI).
   4. استخدم أداة "إضافة قناة" لإضافة قنوات ألوان إضافية ، قناة واحدة لكل فلوروكروم. وبالتالي ، فإن العينة التي تحتوي على كل من DAPI و Alexa Fluor 594 fluorochromes تتطلب قناتين.
   5. استخدم أداة "خصائص الصورة" لتعيين أبعاد البكسل (فوكسيل) الصحيحة (XYZ)، كما هو محدد في 3.7 أعلاه.
   6. استخدم أداة "ضبط العرض" لتغيير ألوان القناة حسب الحاجة (على سبيل المثال ، اضبط قناة DAPI على اللون الأزرق ، وقناة Alexa Fluor 594 إلى اللون الأحمر).
   7. لوضع وحدة التخزين ثلاثية الأبعاد في نافذة الصورة، استخدم ماوس الكمبيوتر للنقر فوق وحدة التخزين وسحبها كما هو مطلوب.
   8. استخدم أداة "لقطة" في شريط الأدوات لإنشاء لقطات شاشة للصورة ثلاثية الأبعاد.
   9. استخدم أداة "الرسوم المتحركة" في شريط الأدوات لإنشاء أفلام لتدوير عينة ثلاثية الأبعاد.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحضير غرفة التصوير. ج: المواد الاستهلاكية المطلوبة لإعداد غرفة التصوير هي أزرق ، عجين اللعب أو ما شابه ذلك ، و 2 غطاء (24 × 50 مم). ب: قم بإعداد شريطين رفيعين من المسمار الأزرق (قطره حوالي 2 مم × 2 سم) ، وغطاءين. ج: ضع شرائط زرقاء على غطاء واحد ، مما يتيح مساحة كافية لخزعة الجلد. ضع خزعة الجلد في قطرة من محلول CUBIC2 بين الشريطين. د

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات بارافورمالدهيد سيجما ألدريتش ص 6418 الإيثانول 96٪ (غير ممس) الإمداد الكيميائي رقم 1170 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول
(دابي) روش 10236276001 N ، N ، N '، N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) إيثيلين ديامين ميرك ميليبور 821940 البولي إيثيلين جلايكول أحادي p-isooctylphenyl الأثير ميرك ميليبور 648462 تريتون X-100 ميرك ميليبور 648462 سكروز سيجما ألدريتش S0389 درجة حرارة القطع المثلى
(أكتوبر) مركب الأنسجة تيك 4583 الجسم المضاد للكيراتين 14 كوفانس PRB-155P الجسم المضاد المضاد ل Ki67 أبكام أب16667 الحمار المضاد للأرانب Alexa 594 تقنيات الحياة أ 21207 ثنائي ميثيل سلفوكسيد سيجما ألدريتش د2650 يوريا ميرك ميليبور 66612 [م] 2،2 ′ ، 2 '-نتريلوتريثانول ميرك ميليبور 137002 مجهر متحد البؤر شركة نيكون إنسترومنتس نيكون A1 - مجهر متحد البؤر كروزر6 ماكينة تشذيب الوجه براون براون كروزر6 فيس أزيد الصوديوم سيجما ألدريتش 438456