$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
< p class = "jove_title" >
1. التعديل الوراثي للخلايا الكيراتينية البشرية الأولية
ملاحظة: استخدم خلايا فينيق برمائية المزروعة في وسائط DMEM كاملة [DMEM + 10٪ مصل بقري جنين (FBS) + قلم / بكتيريا] لإنتاج فيروسات لإصابة الخلايا الكيراتينية البشرية الأولية. يتم دمج جينات التعبئة الفيروسية التي تشفر البروتينات مثل gag-pol والمغلف بثبات في جينوم خلية العنقاء ، مما يسمح بإنتاج الفيروس عند نقله بناقل فيروسي قهقري. يمكن نقل خلايا العنقاء بكفاءة عالية مما يسمح بإنتاج عيار فيروسي عالي. يمكن للفيروسات المنتجة من خط التعبئة هذا أن تصيب أيضا مجموعة كبيرة ومتنوعة من خلايا الثدييات بما في ذلك البشر.
- اليوم 1: في اليوم السابق للتعداء ، تزرع خلايا طائر الفينيق في صفيحة مكونة من 6 آبار بكثافة 800,000 خلية لكل بئر في وسائط DMEM كاملة.
- اليوم 2: يوم التعدي ، استخدم 3 ميكروغرام من نواقل الفيروسات القهقرية لكل بئر. Aliquot 3 ميكروغرام من ناقل الفيروسات القهقرية في أنبوب 1.5 مل. استخدم مزيجا من 100 ميكرولتر DMEM بالإضافة إلى 6 ميكرولتر من كاشف التعداء لكل 3 ميكروغرام من الناقلات. امزج 6 ميكرولتر من كاشف التعداء مع 100 ميكرولتر DMEM في أنبوب سعة 1.5 مل. (يتم سرد نواقل الفيروسات القهقرية المستخدمة في جدول المعدات / المواد)
- احتضن لمدة 5 دقائق وأضف خليط 106 ميكرولتر إلى الأنبوب المفصل مسبقا الذي يحتوي على 3 ميكروغرام من ناقل الفيروسات القهقرية. تخلط وتحتضن في RT لمدة 30 دقيقة. أضف هذا الخليط بالكامل بالتنقيط إلى كل بئر من خلايا العنقاء.
- اليوم 3: في اليوم التالي للتعداء ، قم بإزالة الوسائط من خلايا العنقاء وأضف 2 مل من وسائط DMEM الكاملة الطازجة. في نفس اليوم ، قم بزرع الخلايا الكيراتينية البشرية الأولية في صفائح مكونة من 6 آبار بكثافة 75,000 خلية لكل بئر. الحفاظ على الخلايا الكيراتينية في وسط مصل خالية من الخلايا الكيراتينية (KCSFM) مع المضادات الحيوية (القلم / البكتيريا).
ملاحظه: تم شراء الخلايا الكيراتينية البشرية الأولية. يمكن شراء الخلايا من مجموعة متنوعة من البائعين (المدرجة في جدول المواد).
- اليوم 4: حصاد الوسائط من خلايا طائر الفينيق المنقولة ، والتي تحتوي الآن على جزيئات فيروسية. مرر الوسائط عبر مرشح 0.45 ميكرومتر باستخدام حقنة (لإزالة أي خلايا فينيق ملوثة) وضع 2 مل على الخلايا الكيراتينية (مطلية في 75,000 خلية / بئر في اليوم السابق). أضف سداسي ديميثرين بروميد (5 ميكروغرام/مل) إلى الوسائط للمساعدة في التوسط في عملية العدوى. العيارات الفيروسية هي ~ 1 × 107 TU / مل.
- قم بتدوير الألواح المكونة من 6 آبار في جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 1 ساعة في RT. بعد الدوران ، قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على فيروس واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS قبل إضافة KCSFM.
- اليوم 5: إصابة نفس الدفعة من الخلايا الكيراتينية مرة أخرى كما في 1.4 ، باستخدام 2 مل من الوسائط المفلترة التي تحتوي على سداسي ديميثرين بروميد (5 ميكروغرام / مل). قم بتدويرها عند 200 × جم لمدة 1 ساعة في RT لإزالة الوسائط التي تحتوي على فيروس وغسلها باستخدام 1x PBS ثم أضف KCSFM.
ملاحظه: حدد الخلايا الكيراتينية التي تستخدم دواء إذا كانت هناك علامة قابلة للتحديد على ناقل الفيروسات القهقرية وقم بتوسيعها لاستخدامها في التحليل النهائي أو التطبيقات مثل مزارع النمط العضوي.