مقايسة تكوين مستعمرة الخلايا الكيراتينية: اختبار في المختبر لتقييم قدرة الخلايا الكيراتينية على النمو إلى مستعمرات

الملخص

المصدر: Morris ، R. J. et al. عزل الخلايا الكيراتينية لبشرة الفئران وثقافة الاستمئنان في المختبر. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نجري فحصا استماضيا للخلايا الكيراتينية التي تم حصادها من الفئران البالغة لتحديد قدرة الخلايا الفردية على التكاثر وتشكيل المستعمرات. تقنية حصاد الخلايا الكيراتينية هذه مفيدة لدراسة الجوانب النهائية الأخرى للتسرطن الكيميائي الجلدي وتعزيز الورم.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. حصاد الخلايا الكيراتينية الأولية وبذرها

1. القتل الرحيم لأربع إلى خمس إناث من إناث الفئران البالغة عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂ وفقا لمعايير المنشأة الحيوانية المعتمدة / IACUC. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للفئران الإناث / الذكور العازبة.
   1. قم بقص حوالي 9 سم² من الفراء الظهري بمقص كهربائي وضع جميع الفئران المقطوعة في وعاء سعة 500 مل مع ما يكفي من محلول مطهر بوفيدون اليود (وليس فرك) لتغطيتها لمدة 1-2 دقيقة.
   2. يسكب المحلول ويشطف بالماء النظيف حتى يصبح السائل صافيا. كرر نفس الغسيل المطهر متبوعا بشطف الماء. بعد الغسيل المطهر بمحلول اليود ، انقع جميع الفئران في 70٪ من الإيثانول لمدة 5-10 دقائق < / > ملاحظة: ستحتفظ الفئران ذات الفراء الفاتح (على سبيل المثال ، BALB / c) بلون مصفر طفيف من غسول اليود المطهر ، بينما لن تحتفظ الفئران الداكنة (على سبيل المثال ، C57BL / 6). والجدير بالذكر أن صلاحية الخلية أو نمو الثقافة لا تتأثر بسبب اللون الأصفر.
2. قم بإزالة الجلد الظهري المقطوع بعناية باستخدام ملقط الإبهام والمقص في غطاء التدفق الرقائقي. ضع الجلد الظهري المستأصل في أنبوب مخروطي مملوء ب PBS / 2x gentamycin. تجنب استخدام الجلد الجانبي البطني لمنع تلوث الخلايا الثديية في المزرعة.
3. باستخدام ملقط معقم ومشرط ، ضع جلدا ظهريا واحدا في كل مرة بحيث يكون الجانب المشعر لأسفل على طبق بتري رفيع. ابدأ بكشط جميع الأنسجة تحت الجلد ، بما في ذلك الدهون من الجانب البطني من أنسجة الجلد ، حتى تصبح شبه شفافة. حاول إزالة أقصى آثار للأنسجة تحت الجلد دون تمزق الجلد (جزء بصيلات الشعر). أيضا ، لا تكشط لفترة طويلة وتجنب جفاف الجلد.
   1. احتفظ بالجلد المكشط في محلول PBS حتى تتم معالجة جميع القشرة المتبقية. ثم ، باستخدام مشرط ، قم بتقطيع القشرة إلى شرائح 0.5 سم × 1-1.5 سم وضع الجانب المشعر لأعلى على طبق بتري معقم.
4. قم بعناية بتعبئة 20 مل من محلول PBS/2x Gentamicin الممزوج بالتربسين (0.25٪) في طبق بتري بلاستيكي مقاس 100 مم × 20 مم. باستخدام ملقط معقم ، انقل القشرة وقم بتعويمها على سطح محلول التربسين لمدة ساعتين في حاضنة 32 درجة مئوية.
   ملاحظة: يعد وقت التربسين ودرجة الحرارة أمرا بالغ الأهمية للحصول على عائد جيد من الخلايا الكيراتينية الأولية عالية الزراعة. على الرغم من أن الطرق الأخرى قد توفر عوائد جيدة من الخلايا القابلة للحياة ، إلا أن قابلية زراعة الخلايا الكيراتينية كانت أقل إرضاء.
   1. خلال فترة الحضانة هذه التي تبلغ ساعتين ، قم بتغطية الأطباق بطبقة الكولاجين وضعها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة (انظر الخطوة 1.1.2). بالنسبة للمقايسات الاستئبنية ، يتم طلاء أطباق بتري مقاس 60 مم قبل 24 ساعة من حصاد الخلايا الكيراتينية للسماح لطبقة التغذية 3T3 المشعة بالالتصاق بالقاع والانتشار بالتساوي.
      ملاحظه: يعد طلاء أطباق الاستزراع للثقافة الاستئبنية مهما جدا للارتباط السليم ، وتكوين المستعمرة ، والنمو / التكاثر النهائي للخلايا الكيراتينية للفئران.
5. خطوة كشط البشرة: رتب طبق بتري بلاستيكي مربع معقم وقم بإنشاء سطح بمنحدر 30 درجة لكشط البشرة المناسب مع 15 مل من وسط الحصاد (انظر الجدول 1). قم بإزالة شريط الجلد العائم بعناية من محلول التربسين باستخدام ملقط منحني. ثم ، باستخدام شفرة مشرط جديدة ، اكشط البشرة والشعر في الوسط.
   1. لا تستخدم القوة المفرطة ، ولكن استخدم القوة الكافية لكشط البشرة أو التأثير على بقاء الخلية.
   2. أثناء كشط البشرة ، حافظ على الشفرة عموديا على قطعة الجلد. إذا كانت الشفرة مائلة نحو حركة الشفرة ، فهناك فرص أكبر لتمزق الجلد. إذا كانت الشفرة مائلة بعيدا عن حركة الشفرة ، فهناك فرص أكبر لإزالة البشرة غير المكتملة.
6. اسكب وسط الحصاد الذي يحتوي على خلايا البشرة المكشطة بحذر في وعاء معقم سعة 60 مل (قابل للتعقيم وقابل لإعادة الاستخدام) باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي مقاس 1.5 بوصة. اشطف طبق بتري بوسط حصاد إضافي لجمع خلايا البشرة المتبقية ورفع الحجم النهائي إلى 30 مل. استخدم أداة تقليب مغناطيسية وحركها على حرارة 100 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ستؤدي هذه العملية إلى إزالة خلايا البشرة المحاصرة من الشعر.
7. ضع مصفاة خلوية معقمة 70 ميكرومتر أعلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. تتناسب مصفاة الخلية مع أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
   1. خذ البرطمان داخل غطاء للسلامة البيولوجية. قم بإزالة شريط التقليب واسكب المحتويات في مرشح المصفاة المتصل بأنبوب مخروطي سعة 50 مل. صفي الشعر غير المرغوب فيه وأوراق الطبقة القرنية.
   2. اضغط على الشعر مع مواد الطبقة القرنية داخل المصفاة وقم بمعالجتها لتحرير خلايا الشعر المحاصرة. استخدم 5 مل من وسط الحصاد للسماح للخلايا المحاصرة المتبقية بالتحرير والتدفق إلى الأنبوب. ارفع الحجم الإجمالي إلى 50 مل في أنبوب مخروطي الشكل.
8. قم بتغطية الأنبوب المخروطي سعة 50 مل بترشيح الخلية والطرد المركزي عند 160 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية وأضف 5 مل من وسط الحصاد. أخيرا ، أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق التخلي برفق ~ 20x باستخدام ماصة 5 مل.
   1. في هذه الخطوة ، احتفظ بالخلايا في صندوق ثلج لتجنب أي تجميع. بعد ذلك ، أضف 25 مل من وسط الحصاد وقم بترتيبه مرة أخرى (20-25 ضعفا).
   2. لضمان عدد دقيق للخلايا الكيراتينية في هذه الخطوة ، خذ 1 مل من تعليق الخلية وأضف 19 مل من وسط الحصاد. الآن ، تخفيف الخلية هو 1:20 في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. إذا تم حصاد الخلايا الكيراتينية من فأر واحد ، فاضبط حجم تعليق الخلية. على سبيل المثال ، بدلا من 30 مل ، استخدم 15 مل وقم بتخفيف 1:10 لحساب الخلايا.
9. Pipet 0.5 مل من الخلايا المخففة من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل (تخفيف 1:20) ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل. قم بإزالة 0.2 مل (200 ميكرولتر) من مزيج الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق آخر سعة 1.5 مل وأضف حجما متساويا (200 ميكرولتر) من محلول تريبان الأزرق 0.4٪. امزج هذا المحلول برفق 3x وانقل الخلايا إلى مقياس كثافة الدم لحساب الخلايا الكيراتينية المنواة.
   1. قم بتسجيل جميع الخلايا الزرقاء الداكنة الإيجابية ل Trypan blue كخلايا ميتة غير قابلة للحياة ، وسجل الخلايا الذهبية والوردية الصغيرة كخلايا قابلة للحياة. وبالتالي ، يجب أن يكون العائد النهائي للخلايا الكيراتينية لكل فأر حوالي 30 مليون خلية قابلة للحياة.
10. جهاز الطرد المركزي الأنبوب المخروطي الأصلي سعة 50 مل (من الخطوة 1.8) لمدة 7 دقائق عند 160 × جم عند 4 درجات مئوية. في هذه الخطوة ، قم بإعادة تعليق الخلايا في الوسط المطلوب وقم بالتخفيف المطلوب لخلايا البذر.
    1. للاستزراع الجماعي ، قم بزرع 2 إلى 4 ملايين خلية ذهبية قابلة للحياة في كل طبق بتري 35 مم في وسط زراعة الخلايا (وسط من نوع KGM + مكملات للمزارع أحادية الطبقة) (انظر الجدول 1). بالنسبة لمقايسة الاستملاء (تكوين المستعمرة) ، قم بزرع 1,000 خلية لكل طبق بتري 60 مم على طبقات تغذية الفأر السويسري 3T3 المشع بالأشعة السينية مع طلاء الكولاجين ووسط Willia's E المعدل مع المكملات الغذائية والمصل.
    2. استخدم ما مجموعه 2 إلى 4 مل متوسط لأطباق بتري مقاس 35 مم و 60 مم على التوالي. أيضا ، قم بصياغة DMEM و Williams E الوسيط الذي تم شراؤه من ATCC بمستويات منخفضة من بيكربونات الصوديوم للاستخدام عند 5٪ من ثاني أكسيد الكربون
    .
11. تنمو خلايا المزرعة (الكتلة أو الكلونوجين) عند 32 درجة مئوية ، 95٪ رطوبة مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. قم بتغيير الوسائط بعد يوم واحد من البذر الأولي للثقافة الجماهيرية ، ثم 3 مرات أسبوعيا بعد ذلك. ومع ذلك ، بالنسبة للمقايسات النسيلة ، يكون التغيير المتوسط الأول بعد يومين من بذر الخلايا و 3 مرات أسبوعيا بعد ذلك.
12. بالنسبة للثقافة النسيلة ، قم بزراعة الخلايا على فترات أسبوعين وأربعة أسابيع. بعد الانتهاء من الثقافات النسيلة (2 أو 4 أسابيع) ، استنشق الوسط. ثبت المستعمرات في 10٪ فورمالين مخزن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة وصمة عار مع 0.5٪ من الرودامين B في ماء الأوتوكلاف لمدة 1 ساعة. ثم قم بإزالة بقعة الرودامين B بماصة من حافة الأطباق.
    1. اشطف الأطباق بالماء البارد المعقم حتى تصبح الأطباق صافية. ضعي الأطباق مائلة على غطاء الأطباق واتركيها تجف من أجل العد النهائي للمستعمرة. والجدير بالذكر أنه عند إجراء فحص الثقافة الاستئبنية ، لا تقم أبدا بسحب <1 مل من الخلايا. إذا كانت الخلايا مركزة ، فقم بتخفيف تركيز الخلية بشكل متسلسل.

الحلول والوسائط التعليقات حلول الحصاد 2.5٪ تربسين (5 مل) Dulbecco's PBS (500 مل) جنتاميسين (2 مل) PBS مع 2x gentamycin (45 مل) محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 2x gentamycin محلول التربسين حلول زراعة الخلايا محلول طلاء أطباق Purecol-fibronectin: 1 م HEPES (1 مل) 116 ملي CaCl2 (1 مل) ألبومين مصل الأبقار 1.0 مجم / مل (10 مل) وسط زراعة الخلية (100 مل) فيبرونيكتين (1 مجم) كولاجين بوريكول (1 مل) محلول تجميد الخلايا DMSO (2 مل) DMEM مع 10٪ BCS والقلم العقدي وسط الحصاد يجب أن يكون بدون كالسيوم 2x جنتاميسين (1 مل) FBS (50 مل) SMEM (500 مل) وسائط ويليامز الإلكترونية عالية الكالسيوم مع: EGF (5 ميكروغرام / مل) 1 مل الجلوتامين 14.5 مل هيدروكورتيزون (1 مجم / مل) 0.5 مل الأنسولين 1 مل LinoAcid-BSA (0.1 مجم / مل) 0.5 مل MEM ESS AminoAcids 4 مل فيتامينات MEM 5 مل البنسلين ستربتومايسين 5 مل ترانسفيرين (5 مجم / مل) 1 مل فيتامين أ (1 ملغم/1,000 ميكرولتر) 57.5 ميكرولتر فيتامين E 1 مجم / مل (4 درجات مئوية) 3.5 ميكرولتر فيتامين د2 (10 مجم / مل) 50 ميكرولتر 3T3 الخلايا الليفية وسط النمو الكامل (CGM) BCS (100 مل) DMEM (900 مل) البنسلين الستربتومايسين (10 مل) كيه جي إم الوسط المستخدم للاستزراع الجماعي هو وسط الكالسيوم المخفض موريس 2 متوسط مع نفس المكملات الغذائية مثل ويليامز إي متغير منخفض الكالسيوم من ويليامز إي مع المكملات الغذائية

الجدول 1: وصفات الحلول والوسائط.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.4٪ تريبان بلو 1x في محلول ملحي 0.9٪ لايف تكنولوجيز جيبكو 15250-061 شريط تحريك مغناطيسي مقاس 1.5 بوصة مع حلقة محورية بيل آرت ، واين 371101128 في 2 أوقية جرة نالجينز 10 مل ماصات يمكن التخلص منها بي دي فالكون 357551 قارورة ثقافة 150 سم 2 (T-150) كورنينج 430825 2 أوقية جرة نالجينز ثيرمو فيشر العلمي 2118-0002 60 مل 2.5٪ محلول التربسين 10x لايف تكنولوجيز جيبكو 15090-046 50 مل أنبوب مخروطي معقم بي دي فالكون 352098 مصفاة خلوية ، معقمة 70 ميكرومتر BD Discovery Labware هاتف: 352350 الكولاجين, بقري، النوع الأول، 30 ملغ BD Biosciences 354231 ماء مقطر Milli-Q مصنوع طازجا ؛ ماء التناضح العكسي المقطر مرتين خال من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x و Ca2+ و Mg2+ من Dulbecco لايف تكنولوجيز جيبكو 14190-144 عقيم وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ATCC 30-2002 مصل الأبقار الجنينية (FBS) ثيرمو فيشر العلمي هيكلون ش 300070.03 جنتاميسين 50 مجم / 10 مل لايف تكنولوجيز جيبكو 15750-060 رقم 22 شفرات معقمة من الفولاذ المقاوم للصدأ بي دي بارد باركر 371222 رقم 4 مقابض مشرط أدوات البحث الطبية الحيوية 26-1200 في كوب يحتوي على 70٪ إيثانول زوج واحد من المقصات أدوات البحث الطبية الحيوية 25-1050 في كوب يحتوي على 70٪ إيثانول زوج واحد من ملقط تضميد الإبهام ميليتكس 6-أبريل في كوب يحتوي على 70٪ إيثانول أطباق بتري بلاستيكية معقمة مربعة بي دي فالكون 351112 الخلايا الليفية الفأر السويسري 3T3 ATCC CCL-92 تستخدم في 10 مقاطع ويليامز إي وسط لايف تكنولوجيز جيبكو هاتف: 12551-032 SMEM: Ca2 + و Mg2 + الحد الأدنى من الوسط الأساسي لثقافة التعليق لايف تكنولوجيز جيبكو 11380-037