التحول القائم على ناقلات miniCoopR: تقنية لفحص الجينات المسببة للورم الميلانيني في نموذج ورم الزرد

الملخص

المصدر: Iyengar ، S. et al. فحص معدلات الورم الميلانيني باستخدام نموذج الورم الأصلي لأسماك الزرد. J. Vis. Exp. (2012)

يصف هذا الفيديو طريقة للكشف عن جينات تعديل الورم الميلانيني باستخدام نموذج ورم الزرد المعدل وراثيا. عند حقنها بناقل miniCoopR المسبب للورم الميلانيني ، تصاب سمكة الزرد بأورام ميلانينية وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة العوامل الوراثية التي تؤثر على تطور الورم في أسماك الزرد.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. فحص معدلات ظهور الورم الميلانيني

1. قم بإنشاء استنساخ إدخال البوابة الأوسط بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يؤدي إلى تضخيم إطار القراءة المفتوح الكامل للجينات ذات الأهمية (GOI) وإعادة تجميعها في pDONR 221 باستخدام BP clonase II (Invitrogen). استخدم تقنية Multisite Gateway (Invitrogen) لإعادة دمج p5E_mitfa و pME_GOI و Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA و miniCoopR لوضع الجينات ذات الأهمية تحت محفز mitfa في متجه miniCoopR (الشكل 1 أ).
2. حقن 25 بيكوغرام من كل استنساخ جنبا إلى جنب مع 25 بيكوغرام Tol2 transposase mRNA في خلية واحدة Tg (mitfa: BRAFV600E); ص 53 (LF) ؛ MITfa (LF) أجنة الزرد متماثلة اللواقح الثلاثية كما هو موضح سابقا. احتضان الأجنة المحقونة عند 28.5 درجة مئوية ، قم بإزالة أي أجنة ميتة عند 24 حصان.
3. حدد المعدلة وراثيا ذات الخلايا الصباغية التي تم إنقاذها عند 72 حصانا عن طريق وضع طبق بتري الذي يحتوي على أجنة محقونة على مجهر تشريح تحت ضوء ساقط على خلفية بيضاء (الشكل 1 أ).
4. نقل إلى خزانات سعة 3 لتر في حضانة منشأة أسماك الزرد عند 4 dpf.
5. في شهرين ، حدد التي تحتوي على مساحة واحدة على الأقل من إنقاذ الخلايا الصباغية أكبر من 4 مم² (الشكل 1 أ). هناك علاقة قوية بين درجة إنقاذ الخلايا الصباغية عند 72 HPF ودرجة إنقاذ الخلايا الصباغية في شهرين. عندما يتم اختيار الأجنة التي تحتوي على إنقاذ الخلايا الصباغية عند 72 حصانا ، فإن معظمها (~ 80٪) سيكون لديها منطقة واحدة على الأقل من إنقاذ الخلايا الصباغية أكبر من 4 مم² في شهرين.
6. فحص المختارة أسبوعيا بحثا عن وجود أورام (الشكل 1 ب). هناك علاقة قوية بين التغيرات النسيجية المرضية والمورفولوجية. يتم التعرف على الانتقال من الحميد إلى الخبيث على أنه تغيير مورفولوجي عندما ترتفع الآفات عن سطح. عزل الحاملة للورم للدراسة.
7. ارسم منحنيات البقاء على قيد الحياة الخالية من الورم الميلانيني مع تقدم العمر في الأسابيع على الخراج ونسبة البقاء على قيد الحياة الخالية من الورم الميلانيني على الإحداثيات. تتم مقارنة المصابة بالخلايا الصباغية التي تعبر عن جين مثير للاهتمام بالحيوانات الضابطة التي تعبر عن EGFP (بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز) في الخلايا الصباغية (الشكل 1 ج). يبلغ متوسط ظهور الورم للحيوانات المحقونة ب miniCoopR-EGFP حوالي 18 أسبوعا. حدد ما إذا كان المنحنيان مختلفين إحصائيا باستخدام اختبار رتبة السجل.

النتائج

الشكل 1. فحص معدلات ظهور الورم الميلانيني باستخدام مقايسة miniCoopR. أ) تخطيطي لمقايسة miniCoopR. الجنين مع الخلايا الصباغية التي تم إنقاذها (رأس السهم) التي تحتوي على ناقل miniCoopR والجين المعني. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. بالغ مع إنقاذ الخلايا الصباغية أكبر من 4 مم² (رأس السهم). شريط المقياس = 500 ميكرومتر ب) أنقذ MiniCoopR-EGFP سمكة الزرد مع...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كواشف إعادة تركيب البوابة إنفيتروجين ميني كوبر الجسم المضاد Mitfa FITC الماعز المضاد للأرانب IgG المضاد إنفيتروجين فيكتاشيلد مختبرات ناقلات إتش -1000 سمك الزرد كاسبر 701N 10 ميكرولتر حقنة هاميلتون / فيشر 14-824 مرشح 40 ميكرومتر BD فالكون / فيشر هاتف: 352340 FBS إنفيتروجين 26140079