تلطيخ الأجسام المضادة للخلايا الصباغية القشرية: تقنية للكشف عن عوامل النسخ المعبر عنها في الخلايا الصباغية المرتبطة بالقشور الظهرية لنماذج أسماك الزرد

الملخص

المصدر: Sharanya Iyengar et al. فحص معدلات الورم الميلانيني باستخدام نموذج الورم الأصلي لأسماك الزرد. J. Vis. Exp. (2012)

يصف هذا الفيديو طريقة تلطيخ الأجسام المضادة للكشف عن تعبير عوامل النسخ في الخلايا الصباغية المرتبطة بالقشور الظهرية لنماذج أسماك الزرد. تساعد تقنية التلوين المناعي هذه على وجه التحديد على تحديد عامل التعدي المحفز للخلايا الصباغية - A في أسماك الزرد المعدلة وراثيا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تلطيخ الأجسام المضادة للخلايا الصباغية القشرية

1. اصنع المخزن المؤقت PO₄ مع 80 مل 0.1 مليون Na_{و 2}HPO₄ و 20 مل 0.1M NaH₂PO₄. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 7.3. اصنع 2x إصلاح المخزن المؤقت يحتوي على 8.0 جرام سكروز ، 0.15 مل 0.2 M CaCl₂ ، و 90 مل 0.2M PO₄ المخزن المؤقت ، الرقم الهيدروجيني 7.3. إذا لزم الأمر ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك ، ثم اصنع ما يصل إلى 100 مل باستخدام المخزن المؤقت PO₄.
2. تزن ما يصل إلى 300 مجم من PFA الصلب وأضفها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أضف 5 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم إلى حجم يساوي 4.5 × كتلة ، بالملغ ، من PFA (على سبيل المثال ، 450 ul 5 ملي هيدروكسيد الصوديوم إلى 100 مجم PFA). يسخن على حرارة 60-70 درجة مئوية مع رج عرضي حتى يذوب PFA. قم بتدوير الجسيمات المتبقية واسترجع 20٪ من المادة الطافية PFA. اجعلها طازجة في كل مرة.
3. قم بإعداد محلول التثبيت الذي يحتوي على 1x fix buffer و 4٪ PFA.
4. قم بتخدير السمك في 0.17 مجم / مل من التريكائين.
5. باستخدام الضوء الساقط تحت مجهر تشريح ، نتف المقاييس الظهرية باستخدام ملقط حاد ذو رؤوس دقيقة ، مع الحرص على عدم إتلاف نصف المقياس المحتوي على الخلايا الصباغية (الشكل 1 أ). ضع المقاييس مباشرة من الملقط في محلول تثبيت سعة 1 مل واحتضنه في درجة حرارة الغرفة ، أثناء التقليب ، لمدة 2 ساعة ≥. انقل الأسماك إلى مياه السمك وراقب الأسماك للتأكد من التعافي الناجح.
6. لتبييض الخلايا الصباغية المصطبغة ، اغسل المقاييس الثابتة في PBST (1x PBS pH 7.4 ، 0.1٪ Triton X-100) مرتين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 1 مل من محلول التبييض الطازج الذي يحتوي على 0.4 مل 10٪ KOH و 0.15 مل 30٪ H₂O₂ في 5 مل مع dH₂O. ضع أقفال البارافيلم أو الغطاء لمنع الغاز من فتح الأنابيب. استمر في التبييض حتى تختفي الصبغة (10 دقائق نموذجية) (الشكل 1 ب ، ج). يغسل في PBST أربع مرات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. كتلة لمدة 30 دقيقة على الأقل في محلول كتلة يتكون من 1x PBS درجة الحموضة 7.4 ، 0.2٪ Triton X-100 ، 2 مجم / مل BSA ، 1٪ DMSO ، 0.02٪ NaN₃ ، و 2٪ مصل لحم الضأن. اترك NaN₃ إذا تطور مع تفاعل HRP.
8. احتضان الجسم المضاد الأولي في محلول الكتلة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. يجب أن يكون لديك ما لا يقل عن 400 ميكرولتر من المحلول فوق العينات لإبقائها مغمورة.
9. اغسل المقاييس 3 مرات لمدة 30 دقيقة في PBST في درجة حرارة الغرفة.
10. احتضان بجسم مضاد ثانوي من ساعتين إلى ليلة وضحاها في محلول كتلة في درجة حرارة الغرفة.
11. وصمة عار لمدة 10 دقائق باستخدام PBST + 0.1 ميكرومتر DAPI.
12. اغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام PBST.
13. قم بتركيب المقاييس على شريحة زجاجية في قطرة من vectashield بحيث يكون الجانب المقعر من المقاييس متجها لأسفل باتجاه الشريحة وضع غطاء زجاجي ينزلق فوقها. أغلق حواف الشريحة بطلاء أظافر شفاف وراقب الشرائح تحت مجهر مضان (الشكل 1 د ، ه ، و ، ز).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تلطيخ الأجسام المضادة للخلايا الصباغية القشرية. أ) المقاييس التي يتم قطفها من سمكة زرد صغيرة مخدرة. ب) مقياس غير مبيض مع الخلايا الصباغية المصطبغة و ج) مقياس مبيض من سمك الزرد miniCoopR-EGFP. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. مقياس غير مبيض ملطخ بالجسم المضاد D) Mitfa و E) DAPI. مقيا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كواشف إعادة تركيب البوابة إنفيتروجين ميني كوبر الجسم المضاد Mitfa FITC الماعز المضاد للأرانب IgG المضاد إنفيتروجين فيكتاشيلد مختبرات ناقلات إتش -1000 سمك الزرد كاسبر 701N 10 ميكرولتر حقنة هاميلتون / فيشر 14-824 FBS إنفيتروجين 26140079