فحص الزرع تحت الجلد: طريقة لزرع خلايا الورم الميلانيني من متبرع إلى نموذج سمكة الزرد المتلقية

الملخص

المصدر: Iyengar ، S. et al. فحص معدلات الورم الميلانيني باستخدام نموذج الورم الأصلي لأسماك الزرد. J. Vis. Exp. (2012)

يصف هذا الفيديو طريقة زرع الخلايا السرطانية من نموذج أسماك الزرد المتبرع الحامل للورم الميلانيني إلى متلقي يعاني من نقص المناعة ، أسماك الزرد كاسبر. يساعد على تصور نقش الورم وتكاثره في الأسماك المتلقية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. فحص الزرع

1. تحضير أسماك كاسبر المتلقية البالغة من العمر 2-3 أشهر عن طريق التشعيع ب 25 Gy من تشعيع جاما قبل يوم واحد من الزرع. اسمح للأسماك بالتعافي في ماء السمك.
2. القتل الرحيم لسمكة حاملة للورم وفقا للإرشادات المؤسسية. على وجه التحديد ، توضع السمكة في طبق يحتوي على 0.6 مجم / مل من التريكيين حتى تتوقف حركة الخياشيم.
3. اقطع الورم وضعه في طبق بتري مع فلتر 5 مل تقريبا معقم 0.9x PBS مع 5٪ FBS. قم بتقطيع الورم بشفرة الحلاقة أثناء وجوده في المحلول.
4. العمل في درجة حرارة الغرفة ، قم بعمل ماصة P1000 للحصول على خلايا مفردة. قم بتكوين الحجم حتى 25 مل باستخدام مرشح معقم 0.9x PBS مع 5٪ FBS.
5. تصفية من خلال مرشح شبكة 40 ميكرومتر.
6. قم بالدوران في جهاز طرد مركزي منضدي Eppendorf 5810R بسرعة 1,500 دورة في الدقيقة (453 قدم مكعب) لمدة 10 دقائق.
7. قم بإزالة المادة الطافية واجعل الخلية معلقة إلى التركيز المطلوب تقريبا (افترض 10⁷ خلايا لرم 100 مم³).
8. احسب الرقم الدقيق للخلية باستخدام مقياس كثافة الدم وقم بتخفيف تعليق الخلية بحيث يكون حجم الحقن النهائي حوالي 5 ميكرولتر. على سبيل المثال ، إذا كان سيتم حقن 50,000 خلية ، فيجب تخفيف تعليق الخلية إلى تركيز نهائي يبلغ 10,000 خلية / ميكرولتر ، ونفض الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية كل بضع دقائق لمنع تكتل الخلايا.
9. اغسل حقنة هاميلتون بمقياس 26 ثانية (طرف مائل 701 N 10 μL 2-3 مرات مع 100٪ إيثانول و 0.9x PBS. قم بتحميل المحقنة ب 5 ميكرولتر من تعليق الخلية.
10. تخدير الأسماك المتلقية للإشعاع في 0.17 مجم / مل ثلاثي الكنائن. ضع السمك على جانبه على كيموي رطب (الشكل 1 أ).
11. قم بتثبيت السمكة بيد واحدة وأدخل الإبرة بحيث يكون الشطبة متجهة لأعلى بزاوية 45 درجة في جناح السمكة فوق التجويف البريتوني في منتصف الطريق تقريبا بين الحدود الخلفية للدماغ الخلفي والحدود الأمامية للزعنفة الظهرية. اضغط برفق على المكبس (الشكل 1 ب).
12. اسمح للأسماك بالتعافي في مياه السمك العذبة وراقب الأسماك يوميا بحثا عن نقش الورم (الشكل 1 ج). إذا حدث النقش ، يمكن أيضا ملاحظة استمرار النمو وتطور المرض.

النتائج

الشكل 1. زرع خلايا الورم الميلانيني. أ) سمك الزرد كاسبر غير المحقون. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. ب) موقع الزرع تحت الجلد (رأس السهم) على متلقي كاسبر المشعع مباشرة بعد الحقن ب 50,000 خلية من خلايا الورم الميلانيني. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. ج) متلقي كاسبر مشع يظهر نقش الورم (رأس السهم) بعد أسبوعين من الح...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كواشف إعادة تركيب البوابة إنفيتروجين ميني كوبر سمك الزرد كاسبر 701N 10 ميكرولتر حقنة هاميلتون / فيشر 14-824 مرشح 40 ميكرومتر BD فالكون / فيشر هاتف: 352340 FBS إنفيتروجين 26140079