مقالة منهجية

فحص غزو الخلايا السرطانية: طريقة ثلاثية الأبعاد في المختبر تعتمد على المصفوفة الأصلية لتقييم تفاعلات الخلايا الظهارية واللحمة المتوسطة

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Ng ، Y. Z. et al. هندسة الأنسجة للبيئة المكروية اللحمية للورم مع التطبيق على غزو الخلايا السرطانية. J. Vis. Exp. (2014)

يصف هذا الفيديو تقنية استخدام مصفوفة أصلية لدراسة غزو الخلايا السرطانية. توفر التقنية المستخدمة في هذا الاختبار القدرة على تقييم تفاعلات الخلايا الظهارية واللحمة المتوسطة في بيئة ثلاثية الأبعاد دون الحاجة إلى مصفوفة اصطناعية أو أجنبية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير الوسائط والكواشف

  1. تحضير 200x من مخزون حمض الأسكوربيك 2-فوسفات
    1. قم بإذابة 29 مجم من حمض الأسكوربيك 2-فوسفات لكل 5 مل من محلول Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) وقم بالتصفية من خلال مرشح غشائي 0.22 ميكرومتر. يحفظ على شكل 0.25 مل من الحصص المعقمة عند -20 درجة مئوية.
    2. أضف 0.25 مل من مخزون 200 فول من حمض الأسكوربيك 2-فوسفات إلى كل 50 مل من وسائط الخلايا الليفية (DMEM مع 1٪ L-glutamine و 10٪ مصل بقري جنيني) في اليوم المطلوب ، للحصول على تركيز نهائي قدره 0.1 ملي مولار من حمض الأسكوربيك 2-الفوسفات.
  2. تحضير وسائط نمو الخلايا الكيراتينية
      تم
    1. وصف عزل واستزراع الخلايا الكيراتينية لسرطان الخلايا الحرشفية الأولي (SCC) سابقا. كما يتم وصف تحضير وسائط نمو الخلايا الكيراتينية فيه.
    2. باختصار ، قم بإعداد وسائل الإعلام على النحو التالي:
      300 مل من DMEM و 100 مل من Ham's F-12 مكملة بنسبة 10٪ FBS
      0.4 مجم / مل هيدروكورتيزون
      5 ملغم/مل أنسولين
      10 نانوغرام / مل EGF
      5 مجم / مل ترانسفيرين < br / > 8.4 نانوغرام / مل توكسين الكوليرا
      13 نانوغرام / مل ليوثيرونين
      1x محلول البنسلين والستربتومايسين
فئة

2. البناء في المختبر للمصفوفة الأصلية المشتقة من الخلايا الليفية في الوسائط المكملة بحمض الأسكوربيك 2-الفوسفات

  1. بذرة 200,000 الخلايا الليفية لكل بئر في ألواح 6 آبار (20,000 خلية / سم2) في وسائط الخلايا الليفية المكملة بحمض الأسكوربيك 2-الفوسفات. أعد التغذية كل 2-3 أيام ب 2-5 مل من الوسائط. (ملاحظة: يمكن تعديل تردد إعادة التغذية وحجمها ليناسب الاحتياجات الفردية للخلايا المختلفة.)
  2. ستتشكل طبقة سميكة من الخلايا المضمنة في مصفوفة خارج الخلية في نهاية 6 أسابيع ، مرئية للعين المجردة (الشكل 1). لتحرير هذه الطبقة من لوحة زراعة الأنسجة ، اكشط محيط المصفوفة برفق بطرف ماصة دقيقة سعة 1 مل ثم ادفع حواف المصفوفة باتجاه مركز البئر. يجب أن تكون هذه الطبقة من الخلايا والمصفوفة (المصفوفة الأصلية) قابلة للفصل بسهولة عن سطح اللوحة ، وأن تطفو الآن في الوسائط. انشر المصفوفة الأصلية في الوسائط لتجنب طيها على نفسها.
  3. دع المصفوفة الأصلية تطفو وتعيد تشكيلها لمدة 5 أيام ، مع تغيير الوسائط كل 2-3 أيام. نظرا لقوة الشد وإعادة التصميم الجوهري داخل المصفوفة ، ستتقلص المصفوفة بشكل كبير وتصبح مخفضة إلى مصفوفة أصلية أصغر حجما ولكنها أكثر سمكا ، وجاهزة للاستخدام في فحص الغزو.
< p class = "jove_title" >3. فحص الغزو مع الخلايا الكيراتينية SCC الورم

  1. التقط المصفوفة الأصلية برفق باستخدام ملقط حاد وانقله إلى شبكة النايلون. بمجرد وضعه على شبكة النايلون، انشر المصفوفة برفق لتستلقي بشكل مسطح قدر الإمكان باستخدام طرف ماصة دقيقة سعة 1 مل وملقط غير حاد.
  2. تحضير الأسطوانات النسيلة المعقمة عن طريق تلطيخ كمية صغيرة من الفازلين المعقم في أحد طرفيها.
  3. ضع الأسطوانات النسيلة على المصفوفة الأصلية ، مع وضع جانب الفازلين لأسفل. هذا لضمان إحكام الإغلاق بين المصفوفة الأصلية والحلقات النسيلية.
  4. أضف خلايا cSCC إلى الأسطوانات النسيلة (250.000 خلية في 100 ميكرولتر من وسط نمو الخلايا الكيراتينية).
  5. قم بإزالة الأسطوانات النسيلة بعد 6 ساعات عندما تستقر خلايا cSCC على المصفوفة الأصلية.
  6. ارفع شبكة النايلون مع المصفوفة الأصلية وخلايا cSCC إلى واجهة الهواء السائل على دعم شبكة سلكية من الفولاذ المقاوم للصدأ عازمة.
  7. أضف وسائط نمو الخلايا الكيراتينية المكملة بحمض الأسكوربيك حتى يلامس مستوى الوسائط الجزء السفلي من المصفوفة الأصلية.
  8. قم بتغيير الوسائط كل 2-3 أيام والحصاد في 7 و 14 يوما ، بعد بذر خلايا cSCC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1. سير عمل توليد المصفوفة الأصلية المشتقة من الخلايا الليفية ومقايسة غزو الورم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حمض الأسكوربيك 2-فوسفات سيغما أ 8960 DMEM مع L-glutamine ، 4,500 مجم / لتر D-glucose ، 110 مجم / لتر بيروفات الصوديوم تقنيات الحياة 11995-073 100x البنسلين الستربتومايسين تقنيات الحياة 15070 الفازيلين VWR PROL28908.290 اسطوانات نسلية سيغما Z370789 قرص مرشح صافي من النايلون محب للماء 100 ميكرومتر 25 ميكرومتر قطر 100 / عبوة ميليبور NY1H02500 عازمة الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة سلكية الدعم صنع في المنزل تم صنع الأبعاد بحيث تتناسب الشبكة مع ألواح 6 آبار

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة