Method Article

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/2050

⸱

July 8th, 2010

 , 
1Immunology, University of Toronto, 2Arthritis and Immune Disorder Research Centre, University Health Network (UHN)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه المادة سوف بالتفصيل بروتوكول لقياس النشاط calpain في الخلايا الحية باستخدام الثابتة والتدفق الخلوي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Calpains موجودة في كل مكان داخل الخلايا ، والكالسيوم الحساسة ، البروتياز السيستين محايدة

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد الكواشف

ملاحظة : جميع PBS يحتوي الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 +

  1. كشف الكاشف
    إضافة 20μM - 7 - 4 - الأمينية كلوروميثيل الكومارين ، تي BOC - يسين ، ميثيونين أميد (BOC - LM - تواجه المركز) إلى درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. وسوف تتطلب كل خلية تعليق 2mL كاشف الكشف.
  2. 1 ٪ لامتصاص العرق (خلايا ثابت)
    تمييع 4 ٪ محلول المخزون بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. بارافورمالدهيد قسامة 1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تحديد النشاط في الخلايا calpain 32Dkit الثابتة والذين يعيشون في هذا البروتوكول الفيديو. أدت المعاملة من خط الخلية مع مثبط calpain PD150606 في تثبيط كامل للنشاط calpain في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، أدت المعاملة مع مثبط MEK1 PD98059 في تثبيط كامل للنشاط calpain في الخلايا. إرك هو المنشط الرئيسي لcalpain - 2 3. هذه النتائج تشير إلى أن calpain - 2 النشاط هو السائد في الخلايا 32Dkit. العمل الحالي في مختبرنا تحقق من عواقب زيادة النشاط calpain ومساهمات calpain - 1 و 2.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بدعم من المنح المقدمة من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية ، وسرطان الدم والغدد اللمفاوية والمجتمع في كندا ومؤسسة الليمفوما في كندا.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBS BOC-LM-CMAC 4٪ بارافورمالدهيدInvitrogen

قم بإذابة 4 جرام بارافورمالدهيد في 100 مل PBS. في غطاء الدخان ، سخني العينة مع التحريك حتى تصبح واضحة.
اتركيها تبرد ثم خزنيها في 4 ° ؛ C
PD150606Invitrogenاستخدم PD150606 المعاد تكوينه حديثا لتثبيط الجلسنة القصوى.
PD98059تقنية
AlignFlow و AlignFlow بالإضافة إلى حبات الفلورسنت أنابيب FACSInvitrogen
LSR IIBD Biosciences
pronatant of WEHI-3 يتم استخدامه كمصدر ل IL-3 في هذه التجارب. يتم معايرة كل مجموعة من المواد الطافية WEHI-3 لتحديد التركيز الأمثل المستخدم لنمو خلايا 32Dkit.
إشارات الخلية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
  2. Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
  3. Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Calpain ActivityFlow CytometryFluorescent SubstrateCell FixationInhibitor TreatmentLSRII InstrumentFluorescence DetectionData AcquisitionLive Cell AnalysisFixed Cell Analysis

Related Articles