ويمكن للمنطقة التاج من مختلف متواليات V3 حلقة من السطح المغلف بروتين سكري (gp120) من HIV - 1 هيكليا يتسم في كثير من الحالات قابلة للطي في السيليكو المواقف 10-22 من الحلقة باستخدام دولة من بين الفن منذ البداية خوارزمية قابلة للطي. نحن هنا لشرح للطي والتقييم لهذه المنطقة من الحلقة V3 من سلالة من فيروس نقص المناعة البشرية R2 - 1 ، سلالة تحييد فريد الحساسة مع الخصائص الفنية المحيرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم ميزات التعليم العالي ذات الصلة مناعيا الديناميكية الهيكلية للHIV - 1 حلقة V3 تسلسل R2 بواسطة ولي العهد منذ البداية للطي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد تنوع مستضدي من HIV - 1 طويلة عقبة لتصميم لقاح ، وهذا التباين واضحا بشكل خاص في حلقة V3 من الفيروس بروتين سكري السطح المغلف. اقترحنا في وقت سابق ان يتم تقييد تاج الحلقة V3 ، على الرغم من أن المتغير الديناميكي وتسلسل ، وبين جميع فئات السكان من فيروسات HIV - 1 إلى بنية β - القاسي ذات الصلة مناعيا العالي. الأهم من ذلك ، هناك الآلاف من مختلف متواليات V3 تاج حلقة في تعميم HIV - 1 الفيروسات ، مما يجعل من توصيف الهيكلية 3D الاتجاهات عبر تنوع الفيروسات التي من الصعب أو المستحيل البلورات أو الرنين المغناطيسي النووي. تستخدم دراساتنا السابقة الناجحة مع للطي للتاج V3 1 ، 2 الخوارزمية أساسه 3 في متناول ICM النمذجة الجزيئية برو حزمة برامج (Molsoft ذ م م ، لاجولا ، كاليفورنيا) ، واقترحت أن تاج الحلقة V3 ، وتحديدا من مواقف 10-22 ، والفوائد بما يكفي من المرونة وطول السيقان والخمسين المرافقة تتصرف الى درجة كبيرة كما لو كانت غير مقيدة للطي الببتيد بحرية في الحل. كما وسريع مثل للطي من أساسه جزء فقط من هذه الحلقة V3 أي سلالة الفردية لل60000 + يمكن تعميم HIV - 1 سلالات يكون غنيا بالمعلومات. هنا ، نحن مطوية حلقة V3 من سلالة R2 للحصول على نظرة ثاقبة على أساس الهيكلية للخصائص فريدة من نوعها. R2 يحمل حلقة V3 تسلسل النادرة التي يعتقد أنها مسؤولة عن الحساسية رائعة من هذه السلالة لتحييد بواسطة الأمصال المريض والاجسام المضادة 4 ، 5. ويتوسط CD4 سلالة مستقلة العدوى وظهور الأجسام المضادة لانتزاع تحييد على نطاق واسع. نحن لشرح كيفية تقييم نتائج يمكن أن تكون قابلة للطي معلوماتية لربط الهياكل التي لوحظت في للطي مع أنشطة مناعية لوحظ R2.
البروتوكول
1. المنهجية
- الخطوة الأولى من البروتوكول هو لتحديد تسلسل تاج V3 كنت ترغب في أضعاف في السيليكو. لسلالة R2 ، لهذا التسلسل هو جزء KSIPMGPGRAFYT.
- ينبغي أن يبنى هيكل 3D الذرية من الببتيد المقابلة لهذا التسلسل في الفضاء الافتراضي للكمبيوتر. الأمر ICM لذلك هو :
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
أو ملف : جديد : يمكن تحديد الببتيد تحت القائمة المنسدلة - ثم يتم تعيين العديد من المعلمات من الإجراءات ، بما في ذلك عدد من الخطوات للبحث (طول البحث) ، ودرجة الحرارة والمحاكاة ، والمعلمات استراتيجية البحث بما في ذلك القيود على انحياز والمتغير في البحث نحو المناطق معقولة ، حيث الطاقة ، واختيار أساليب مختلفة حساب الطاقة ، ويجب أن يتم تسجيل المعلمات تشير الكيفية التي سيتم تسجيلها في البحث ، مثل ما إذا كنت تريد تسجيل فيلم وكيفية العديد من التشكل التهديف وسيطة. وقد تم تحسين جميع هذه المعلمات بواسطة المنشورات السابقة (انظر www.molsoft.com).
- ثم يبدأ للطي مع الأمر :
مونتيكارلو
أو ملف : جديد : يمكن تحديد الببتيد تحت القائمة المنسدلة الميكانيك الجزيئي : تصغير : العالمي
في الحالة الأولى ، يجب تعيين المعلمات من الخطوة 3 واحدا تلو الآخر في سطر الأوامر. في الحالة الأخيرة ، يتم توفير مربعات للمعلمات الأكثر شيوعا في اختيار جزء قبل تنفيذ الأمر. للراحة ، ويظهر نفس السيناريو ICM لطي تستخدم لهذه التجربة والتجارب التي تم نشرها مسبقا هنا :
يمكن حفظ هذا البرنامج النصي في ملف نصي وتشغيل للكمبيوتر من نظام التشغيل سطر الأوامر (عادة لينكس) سريعا باستخدام الأمر :
ICM _foldingscript
2. أسرار النجاح
- حلقة V3 هو ثابت 35 الأحماض الأمينية في الطول في كل جانب تقريبا من سلالة معروفة ، بحيث يتم ترقيم مواقف الأحماض الأمينية 1-35 بدءا من ثاني كبريتيد منشؤها المستعبدين سيستين في 1 وتنتهي المقابلة مع ثاني كبريتيد المستعبدين سيستين في 35. نظرا لأنه يشكل جزءا من حلقة ، ينبغي أن تكون حدود تاج V3 التي يتم اختيارها بعناية. إذا ما تم اختيار جزء كبير جدا ، فإنه من غير المحتمل أن تتصرف كما قطعة بحرية مرنة كما لو كانت الببتيد الحرة ، وبالتالي فإن المحاكاة للطي ولن يقيم بشكل صحيح البنية. إذا ما تم اختيار جزء صغير جدا ، قد بنية معلوماتية التعليم العالي لا يشكل في المحاكاة. وأظهرت دراسة سابقة أن لدينا جزء من المركز 10 الى المركز 22 ارتبط التشكل البلورات الضد ملزمة ، لذلك هذا هو جزء من أي حلقة V3 التي ينبغي اختيارها للطي.
- على الرغم من استخدام واجهة المستخدم الرسومية وسحب أسفل القوائم غير سهلة ، والعمل على طي ناجحة قبل الببتيد بصفة عامة والحركة باستخدام V3 القابلة للطي حلقة تاج ولا سيما استخدام السيناريو أعلاه ، ببساطة تعديل تسلسل في خط buildpep وتشغيل ينصح النصي أعلاه من سطر الأوامر.
3. ممثل النتائج
نتائج للطي R2 وممثل عن أي نتائج حلقة V3. لتقييم النتائج ، ينبغي فتح ملف المشروع (سيتم تسميتها "newProject1.icb" من السيناريو أعلاه) و "الميكانيك الجزيئية ، المكدس ، عرض" الذي تم اختياره. سيكون جدول لتظهر كومة التشكل. يمكن أن يكون التشكل المكدس تصور بيانيا عن طريق النقر على رمز القطعة / الرسم البياني. وقال "الجزيئية الميكانيك ، المكدس ، العب" صنع فيلم من المكدس لنقدر بصريا تفضيلات متعلق بتكوين التي كشف عنها للطي. لتسلسل R2 ، على التشكل هو بيتا مثل دبوس الشعر كما هو متوقع لحلقات V3 2 -- لا سيما في جزء من مواقف 12-14 حيث ينظر اضحة β الجديلة أفضلية في جميع أنحاء المكدس ، وعدد قليل جدا من التشكل ألفا حلزونية وينظر. وعلاوة على ذلك ، ينظر إلى وجود فجوة الطاقة في ما يقرب من 3 وحدات بين التشكل أدنى الطاقة وثاني أدنى التشكل الطاقة. من نقطة حيوية للعرض ، وهذا يعني أن الهيكل مضات الوحيد للخروج من التشكل أدنى طاقة أقل من واحد في المئة من الوقت : نتائج قابلة للطي لذا أقترح أن V3 R2 التاج هو جامد ، وليس مرنا ، الهيكل. قد تكون هناك ميزات إضافية هيكلية مهمة في مجموعة متكاملة من التشكل ، لكنها من الصعب تقدير منهجي.
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447 - 52D 50 بتوقيت جرينتش | 15 | 0.00061 | 0.00078 |
الجدول رقم 1 : تحييد النسبية للJRFL وV3 R2 حلقات في أماكن المقنعة وغير المقنعة. وأفيد سابقا البيانات في T. كاردوزو ، وآخرون. ARHR (2008) وبينتر ، A. ، وآخرون. بن J. Virol (2004). باختصار ، تم تحديد النشاط تحييد مع مقايسة العدوى دورة واحدة باستخدام psVs ولدت مع الحياة الفطرية أو المعيبة ، معربا عن luciferase pNL4 - 3.Luc.RE - البلازميد pseudotyped مع JRFL بيئية أو المتغيرات V3 SF162 المذكورة أعلاه : JRFL يحتوي على SF162_V3JRFL V3 تسلسل حلقة في مكان تسلسل SF162 حلقة V3. SF162_V3R2 يحتوي على حلقة V3 التسلسل R2 بدلا من تسلسل SF162 حلقة V3. وحضنت وpsVs مع التخفيفات المتسلسلة من 447 خريطة موقع 52D مقابل 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية ، ثم تضاف إلى CD4 + + CCR5 الخلايا المستهدفة U87 مطلي 96 - جيدا في لوحات في حضور polybrene (10 ملغ = مل). بعد 24 ساعة ، تم refed مع الخلايا المتوسطة RPMI تحتوي على 10 ٪ و 10 ملغ FBS = polybrene مل ، يعقبه ح 24-48 إضافية للحضانة. تم تحديد النشاط Luciferase 48-72 ساعة بعد العدوى مع luminometer وحة microtiter (HARTA ، وشركة) باستخدام الكواشف مقايسة من التتر Promega ، وشركة هندسية لتحييد يعني 50 ٪ (GMT50) بواسطة 52D - 447 والتي يحددها الاستيفاء من منحنيات وتحييد هي متوسطات لا يقل عن ثلاثة فحوصات مستقلة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أساسها منذ البداية للطي يكشف الخصائص الهيكلية الثالثية ، والآثار التي قد لا يكون واضحا من دراسة الأحماض الأمينية الفردية بالتسلسل. وكشفت العديد من الخصائص الهيكلية غامضة سابقا من تاج R2 حلقة V3 من محاكاة للطي. وقد لاحظ هذه التفضيلات الهيكلية ترتبط الخصائص الفنية لوحظ من سلالة R2 ، وهي حساسية لتحييد وhyperinfectivity 5.
أولا ، لوحظ واضحة β الجديلة ميل في النصف N - R2 محطة للتاج على مواقع V3 12-...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد العمل من المنح المقدمة من مؤسسة بيل وميليندا غيتس (# 38631) ، والمعاهد الوطنية للصحة ، بما في ذلك OD004631 DP2 وAI084119 R01.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ICM-Pro | شركة Molsoft LLC |
المراجع
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
