لدراسة في الجسم الحي نمو الورم ورم والمكروية ، استخدمنا نموذج الفأر مسانج ومثلي من سرطان المبيض في الحيوانات مناعيا. transduced نحن خلية الورم خط الماوس (MOV1) مع بروتين فلوري Katushka (MOV1 كات) ، وهنا نعرض لها مثلي في زرع المبيض و في الجسم الحي التصوير.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج مثلي من سرطان المبيض في الفئران مصلي مناعيا ل في الجسم الحي التصوير الورم ورصد الاستجابات المناعية ورم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
خلفية : عادة يتم تشخيص سرطان المبيض في مرحلة متقدمة حيث نسبة حالة / وفيات مرتفعة وهكذا يظل الأكثر فتكا من جميع سرطانات الجهاز التناسلي للمرأة بين النساء في الولايات المتحدة 1،2،3. الأورام المصلية هي الأشكال الأكثر انتشارا من سرطان المبيض وراثيا على 4،5 TG - MISIIR أبوغزاله يمثل نموذج الفأر الوحيد الذي يتطور بشكل عفوي هذا النوع من الأورام. TG - MISIIR أبوغزاله الفئران أعرب SV40 تحويل المنطقة الخاضعة لسيطرة العقاقير المثبطة مولر النوع الثاني من مستقبلات (MISIIR) مروج الجين 6. وقد تم تحديد خطوط إضافية المعدلة وراثيا التي تعبر عن العلامات SV40 والتحوير ، ولكن لا تطور أورام المبيض. ورم غير الفئران المعرضة للمعرض عمر نموذجية لC57Bl / 6 الفئران وخصبة. ويمكن استخدام هذه الفئران كمتلقين طعم خيفي مسانج للخلايا السرطانية المعزولة من TG - MISIIR - TAG - DR26 الفئران.
الهدف : على الرغم من التصوير الورم ممكن 7 ، الكشف المبكر عن الأورام العميقة الصعبة في الحيوانات الحية الصغيرة. لتمكين الدراسات قبل السريرية في نموذج حيواني سليمة مناعيا لسرطان المبيض المصلي ، وصفنا نموذج الفأر مسانج لهذا النوع من سرطان المبيض الذي يسمح التصوير في الجسم الحي ، ودراسات للالمكروية الورم ورم والاستجابات المناعية.
طرق : أولا نحن المستمدة TAG سرطان الماوس + خط الخلية (MOV1) من ورم المبيض العفوي المقطوع في الأسبوع 26 من العمر من العمر TG - MISIIR أبوغزاله DR26. ثم ، فإننا transduced ستابلي MOV1 الخلايا مع متجه الفيروسة البطيئة TurboFP635 الثدييات التي تكود Katushka ، متحولة بعيدة للبروتين أحمر فلوري في البحر الأحمر من Entacmaea quadricolor النعمان مع الإثارة / الانبعاثات في ماكسيما 588/635 8،9،10 نانومتر. نحن مزروع orthotopically MOV1 كات في المبيض 11،12،13،14 غير الورم الفئران TG - MISIIR أبوغزاله الإناث عرضة. وأعقب تطور الورم عن طريق التصوير الضوئي في الجسم الحي والمكروية الورم كان تحليلها من قبل المناعية.
المتقدمة مزروع Orthotopically MOV1 خلايا أورام المبيض كات مصلي : النتائج. يمكن MOV1 الأورام كات يمكن تصور من قبل في مجال التصوير فيفو تصل إلى ثلاثة أسابيع بعد الزرع (الشكل 1) وكانت مخترقة مع الكريات البيض ، كما لوحظ في سرطان المبيض الإنسان 15 (الشكل 2).
الاستنتاجات : نحن تصف نموذجا مثلي من سرطان المبيض مناسبة للتصوير في الجسم الحي من الأورام في وقت مبكر نظرا لارتفاع درجة الحموضة في المحافظة على استقرار وصمود للضوء من Katushka في الأنسجة العميقة. نقترح استخدام هذا النموذج مسانج رواية الاصابة بسرطان المبيض لمصلي في الدراسات المجراة التصوير ورصد الاستجابات المناعية الورم والمناعية.
البروتوكول
1. خلية ثقافة
- قبل الحقن مثلي ، والثقافة MOV1 خلايا كات ، والمستمدة من DR26 الأورام ، في قارورة T175 حتى انهم 90 ٪ متموجة. خطة لاستخدام 1-5000000 الخلايا في الحقن ، وهو ما سيتطلب 1 أو 2 T175 القوارير.
- في يوم من الحقن ، وحصاد الخلايا وتحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- مرة واحدة وقد تم تحديد تركيز الخلية ، بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز X 300 في درجة حرارة الغرفة.
- بعد زيادة ونقصان ، resuspend الخلايا لديك 1 مليون نسمة في 10 microliters من برنامج تلفزيوني العقيمة مع EDTA 0.002 M
2. قبل الجراحة
- قبل الجراحة ، وتملأ حقنة الأنسولين مع الخلايا 3/10cc MOV1 كات - 1 مليون في 10 microliters EDTA من برنامج تلفزيوني.
- نقل ماوس isofluorane تخدير لوحة التدفئة. إضافة مرهم العين لمنع جفاف العين. ثم ، تضاف فورا رأس الحيوان في مخروط الأنف نظام متصلة المرذاذ isoflurane لتسليم جميع أنحاء التخدير الجراحة.
- بعد تطهير مكان الحقن مع مسحات الكحول ، وحقن تحت الجلد 5 ملغ / كلغ من كيتوبروفين ، وهو مسكن ما قبل الجراحة ، مع حقنة الانسولين 3/10cc.
- باستخدام مقص ، حلاقة الجزء الأيسر من الذيلية ظهر من مفرق الصدرية الى قاعدة الذيل للحيوانات. تطبيق كريم إزالة الشعر لإزالة الشعر. ثم ، إزالة الزائدة مع منشفة ورقية مبللة.
- بمجرد إزالة الشعر ، وتعقيم المنطقة حلق مع بوفيدون اليود ومسحات الكحول. ثم ، وضع ثنى الجراحية في جميع أنحاء المنطقة من شق.
3. جراحة
- قبل الجراحة ، وضبط مستويات المرذاذ isoflurane إلى 1.5 ٪.
- تحقق من أن هذا الحيوان هو تخدير تماما معسر لوحة القدم.
- المقبل ، وحدد موقع الطحال تحت الجلد. ثم استخدام مقص جراحي ، وجعل شق ظهراني 1-2 سم طويلة على أعلى يمين الطحال.
- تشريح الحيز خلف الصفاق. وسيراعى في لوحة المحيطة المبيض الماوس. استخدام ملقط منحنية لفهم وفضح لوحة الدهون المحيطة المبيض الماوس.
- هيدرات الجهاز مع بعض قطرات من برنامج تلفزيوني العقيمة.
- استخدام ملقط منحنية لفهم ، يتراجع... موقف... ومن ثم تأمين المبيض للحقن
- بينما يمسك بحزم المبيض مع ملقط ، وضخ 10 microliters MOV1 من الخلايا السرطانية في المبيض كات. وهناك إدراك الشركة منع تسرب السوائل أو قلس.
- مباشرة بعد الحقن ، والافراج عن التوتر التي تبذلها ملقط. ينبغي أن ثقب في المبيض يتراجع عفويا وثيق.
- باستخدام حمض خياطة Polyglycolic امتصاص المرفقة إبرة ، أغلق الجرح الرجعية البريتوني.
- الافراج عن الحيوان من مخروط الأنف.
- تمدد الجلد وختم حواف الجرح ظهراني مع بضع قطرات من لاصق الأنسجة.
- أخيرا ، تدير 100 microliters شفويا من المضادات الحيوية للحيوانات. ثم ضع مرة أخرى في قفص ، ورصد لتحقيق الانتعاش. ابقاء الحيوانات على المضادات الحيوية في مياه الشرب لمدة أسبوع.
4. التصوير في فيفو
- بعد أسبوع واحد مثلي من حقن الخلايا السرطانية MOV1 كات ، نفذ في التصوير الجسم الحي. تبدأ عن طريق نقل ماوس isofluorane تخدير إلى غرفة التصوير.
- بدوره مستوى المرذاذ isoflurane وصولا الى 2 ٪.
- فيفو أداء في مجال التصوير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لنظام التصوير. في هذا الفيديو ، سيتم استخدام نظام لومينا.
- لصورة ، انقر فوق البرنامج صورة حية رمز سطح المكتب. ثم في لوحة التحكم IVIS اقتناء ، حدد "تهيئة". ضبط الصك هي مماثلة لإعدادات الكاميرا
- على اقتناء لوحة التحكم إعداد المعلمات حيازة الصك. لمضان ، تحقق "نيون". فوق مربع الصورة للحصول على صورة فوتوغرافية مع كل صورة.
- المقبل ، ضبط الوقت والتعرض للسيارات. تحت عنوان "binning بكسل أو قرار اتفاقية مكافحة التصحر" ، تحقق "متوسطة". ثم وكيل F / إيقاف أو الفتحة ، والتحقق من قيمة 2. المقبل ، حدد تصفية 535 الإثارة وتصفية DsRed الانبعاثات.
- تحت مجال الرؤية ، انقر على الصورة لمشاهدة باء ماوس واحدة.
- ثم انقر على اكتساب للبدء في الحصول على الصور.
- بمجرد الحصول على الصور اكتمال استخدام منطقة سياحية ، أو العائد على الاستثمار ، وأداة لقياس الإشارة. انقر على أيقونة قياس للافراج عن القيم إشارة والمنطقة.
- أخيرا ، انقر على "حفظ" لحفظ الصورة في مجلد المستخدم
- بعد أن تم حفظ الصور ، والتوقف عن إقامة isoflurane والعودة إلى قفصه الماوس. يجب الماوس يستيقظ على الفور.
5. ممثل النتائج
التي تستخدم هذا البروتوكولويمكن رصد النمو في الجسم الحي من سرطان المبيض مثلي ما لا يقل عن 3 أسابيع باستخدام إجراء غير الغازية.
تم حقن orthotopically الشكل 1. MOV1 خلايا كات ، أو برنامج تلفزيوني على السيطرة السلبية ، في المبيض من الفئران غير المعرضة للورم (حق الحيوان والحيوان واليسار على التوالي) ، وفي التصوير فيفو أجري 2 أسابيع في وقت لاحق. تم قياس الانبعاثات الناتجة عن مضان خلايا كات MOV1 engrafted في المبيض وذلك بالمقارنة مع من الفأر السيطرة السلبية.
وكانت ملطخة الشكل 2. أقسام مجمدة MOV1 من أورام المبيض كات مع CD4 مكافحة biotinylated خريطة موقع تليها الركيزة DAB (بني غامق) للكشف عن الاورام الليمفاوية التسلل (السهم الأسود). وcounterstained الخلايا مع الأخضر الميثيل لتصور نواة الخلية (الأزرق). وكانت الخلايا السرطانية (السهام الحمراء) شكليا متميزة من خلايا تي. الشريحة يظهر تضخيم 40X.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الجراحة والحقن مثلي
حقن مثلي في جراب المبيض مطالب التدريب والدقة. وبالتالي
- في حالة سوء الممارسة الجراحية والخبرة مع الجثث الاولى.
- استخدام الإناث تفضيلي multiparous (واحد أو اثنين الفضلات) لأنها تضع أكبر المبيضين مع مرور الوقت مما يسهل بقاء الحقن وزيادة مقارنة مع الإناث nulli...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل منظمة العفو الدولية NIH P01 منح 068730 (SNC ، NS) ، ومنح CA016520 المعاهد الوطنية للصحة / TAPITMAT (NS) ، والتمويل من القطاع الخاص من مؤسسة Claneil (NS) ، والمبيض بوغ الإطارية بشأن تغير المناخ ، ومنحة لجامعة ولاية بنسلفانيا ( CA83638 P50) وفوكس تشيس للسرطان مركز الأساسية غرانت (P30 CA06927) (DCC). المؤلفان بالشكر إلى المساعدة التقنية الممتازة لمرفق كور البصرية / ضوء بارد من إخراج الدكتور EJ Delikatny في جامعة بنسلفانيا انتوني Secreto ، من الخلايا الجذعية الأساسية طعم أجنبي وإخراج G. Desnoyers - دانيه الدكتور في جامعة بنسلفانيا للسرطان مركز للتدريب لSNC تقنية الحقن مثلي وDangaj Denada في جامعة بنسلفانيا / OCRC للمساعدة في عملية جراحية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM-GLUTAMAX | Invitrogen | 10564-011 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14040 | |
| Versene | Lonza Inc. | 17-711E | |
| وسادة تدفئة | Deltaphase | 39 DP | |
| وسادات بوفيدون | Dynarex | 1108 | |
| وسادات كحولية | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| مرهم الدموع الاصطناعية | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 17845-153 | |
| كيتوبروفين | Fort Dodge Animal Health | ||
| سرنجة أنسولين 3cc | BD Biosciences | 309301 | |
| خيط جراحي/إبرة من حمض البولي جليكوليك (3/8 19mm) | Syneture | 9612-31 | |
| لاصق أنسجة | Vetbond | 3M | |
| فيت باكتريم/ معلق فموي | Hi-tech Pharmacal | 840823 | |
| IVIS-Lumina | Caliper Life Sciences | ||
| إيزوفلوران | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | J108013 | |
| مصل جنين البقر، مؤهل | Invitrogen | 10437036 | |
| بنسلين/ستريبتومايسين | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| ناقل TurboFP635 للثدييات | Evrogen | FP721 | |
| دوارق T175 | cellstar | 660-190 |
المراجع
- Etzioni, R., et al. The case for early detection. Nat Rev Cancer. 3, 243-252 (2003).
- Sasaroli, D., Coukos, G., Scholler, N. Beyond CA125: the coming of age of ovarian cancer biomarkers. Are we there yet. Future Medicine. 3, 275-288 (2009).
- Anderson, G. L., et al. Assessing Lead Time of Selected Ovarian Cancer Biomarkers: A Nested Case Control Study. J Natl Cancer Inst. 102, 26-38 (2010).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev 22. , 255-288 (2001).
- Dubeau, L. The cell of origin of ovarian epithelial tumours. Lancet Oncol. 9, 1191-1197 (2008).
- Connolly, D. C., et al. Female mice chimeric for expression of the simian virus 40 TAg under control of the MISIIR promoter develop epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 63, 1389-1397 (2003).
- Hensley, H., et al. Magnetic resonance imaging for detection and determination of tumor volume in a genetically engineered mouse model of ovarian cancer. Cancer Biol Ther. 6, (2007).
- Deliolanis, N. C., et al. Performance of the red-shifted fluorescent proteins in deep-tissue molecular imaging applications. J Biomed Opt. 13, (2008).
- Hoffman, R. M. A better fluorescent protein for whole-body imaging. Trends Biotechnol. 26, (2008).
- Shcherbo, D., et al. far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 4, 741-746 (2007).
- Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13, 283-286 (1993).
- Kiguchi, K., et al. A patient-like orthotopic implantation nude mouse model of highly metastatic human ovarian cancer. Clinical & experimental metastasis 16. , 751-756 (1998).
- Bao, R., et al. Activation of cancer-specific gene expression by the survivin promoter. J Natl Cancer Inst. 94, 522-528 (2002).
- Connolly, D. C., Hensley, H. H. Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In situ -Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents. Current Protocols in Pharmacology 45. , 1-36 Forthcoming.
- Milne, K., et al. Systematic analysis of immune infiltrates in high-grade serous ovarian cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors. , (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
