Method Article

تحليل الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام الأجهزة Cryosections مضغي الشكل

DOI:

10.3791/2344

⸱

December 8th, 2010

 ,  ,  ,  , 
1Laboratório Nacional de Céulas-Tronco Embrionárias (LaNCE), Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brazil

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية المحفزة المتنامي في تعليق تفرق في الهيئات مضغي الشكل (EBS). نحن هنا لشرح كيفية الحصول على جودة عالية cryosections EB مفيدة لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية لمرحلة التطور الجنيني ، مع الحفاظ على مؤسساتهم والمجاميع.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجذعية الجنينية (ES) الخلايا هي الخلايا المحفزة المستمدة من كتلة الخلايا الداخلية للأجنة في مرحلة الكيسة أوائل الثدييات 1. مرحلة حاسمة في التفريق بين الخلايا وفاق هو تشكيل هيئات مضغي الشكل (EBS) المجاميع 2 ، 3. ويستند تشكيل المجلس التنفيذي على تجميع عفوية عندما يتم استزراع خلايا ES في لوحات غير ملتصقة. يلخص EB ثلاثي الأبعاد جوانب كثيرة من الثدييات الجنيني المبكر ، والتفريق في الطبقات الجرثومية الثلاث : الأديم الظاهر ، الأديم المتوسط ​​والأديم الباطن 4.

وتستخدم على نطاق واسع والمناعي في الموقع التهجين التقنيات للكشف عن الهدف والبروتينات الموجودة في خلايا مرنا من قسم النسيج 5 ، 6 ، 7. نقدم هنا تقنية بسيطة لتوليد cryosections عالية الجودة للهيئات مضغي الشكل. هذا النهج يعتمد على التوجه المكاني لتضمين EB في أكتوبر تليها تقنية cryosection. يمكن أن يتعرض المقاطع مما أدى إلى طائفة واسعة من الإجراءات التحليلية من أجل تميز السكان من الخلايا التي تحتوي على بروتينات معينة ، أو الحمض النووي الريبي DNA. في هذا المعنى ، وإعداد cryosections EB (10μm) هي الأدوات الأساسية للتحليل تلطيخ الأنسجة (مثلا Hematoxilin ويوزين ، دابي) ، المناعي (مثل Oct4 ، nestin) أو التهجين في الموقع. هذه التقنية يمكن أن يساعد أيضا في فهم جوانب من مرحلة التطور الجنيني فيما يتعلق بالحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد كروية EBS.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التثبيت والحفظ بالتبريد

ومثقف الخلايا الجذعية المحفزة على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) المعطل مع C mitomycin والمحافظة عليها في DMEM/F12 تستكمل مع خروج المغلوب استبدال 20 ٪ المصل (KSR) و8ng / مل من عامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل - 2). من أجل حمل EB تشكيل نقلوا H9 الخلايا غير ملتصقة الأطباق وتربيتها لمدة 7 أيام ، في الحفاظ على DMEM/F12 تستكمل مع 15 ٪ KSR 8.

مذكرة (!) : يمكن استخدام هذه التقنية لEBS المستمدة من أي خلية جذعية جنينية والمحفزة التي يسببها.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    الأسلوب الموصوفة هنا يوفر وسيلة سهلة لمتابعة بروتوكول للحصول على أبواب ثابتة PFA ناظم البرد رقيقة من الهيئات مضغي الشكل مفيدة للالمناعي والمقايسات التهجين الموقع. وcryosections الناتجة تسمح بدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية التمايز ، مع الحفاظ على هيكلها وتنظيمها والمجاميع.

    ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وأيد هذا العمل من قبل قرينتها دي أمبارو a Pesquisa تفعل استادو دو ريو دي جانيرو (FAPERJ) ، ناسيونال دي Conselho Desenvolvimento Científico تكنولوجيكو ه (CNPq) والمعهد الوطني للبحوث والتكنولوجيا Ciência ه (INCTC). ونحن ممتنون لبرونا S. M. بولسن وألين فرنانديز للصور EB.

    ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    D (+)كاشفVetec228
    كاشف ParaformaldehydeRieden-de Ha &# 235 ؛ n16005
    محلول PBSكاشفLGC Biotecnology13-30259.05
    كاشفهيدروبروميد بولي إل ليسينسيجما ألدريتشP2636200 مجم / مل في الماء
    الأنسجة المائية كاشف مركبساكورا فينتيكP2636
    كاشفمحلول السكروز10٪ محلول السكروز في PBS w / v
    كاشفمحلول السكروز20٪ محلول السكروز في PBS w / v
    كاشفمحلول السكروز30٪ محلول السكروز في PBS w / v
    أداةالأنبوب المخروطيTechno Plastic Products9101515 مل أنبوب مخروطي
    لوحةشاكر أداةخلاط
    أداة CryostatLeica MicrosystemsCM 1850
    قالب لمنصة OCTأداةقالب بلاستيكي plataform
    السكروز حيوي

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
    2. Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Embryoid BodiesCryosection TechniqueImmunofluorescence AnalysisIn Situ HybridizationEmbryonic Stem CellsOCT EmbeddingSucrose CryoprotectionParaformaldehyde FixationTissue SectioningGerm Layer Differentiation

    Related Articles