توصيل فيروسي مستهدف إلى الخلايا العصبية القشرية النخاعية في فأر حديثي الولادة لدراسة إصابة الحبل الشوكي

الملخص

المصدر: Smit, R. D., et al. استهداف القناة القشرية الشوكية في الفئران حديثي الولادة بناقل مزدوج الفيروس باستخدام جراحة الدماغ والعمود الفقري المشتركة. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو التوصيل المستهدف للنواقل الفيروسية إلى الخلايا العصبية القشرية الشوكية في فأر حديثي الولادة. يتيح البروتوكول التعبير الجيني الدقيق باستخدام الحقن الفيروسية الأمامية والرجعية ، مما يسهل البحث في التجديد العصبي واللدونة بعد إصابة الحبل الشوكي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الحقن المباشر في الحبل الشوكي الذي يستهدف أطراف المحور العصبي

1. باستخدام طرف إبرة الحقن الزجاجية ، قم بتقريب خط الوسط للحبل الشوكي عن طريق تحديد الشريان الشوكي. ومع ذلك ، إذا كان الشريان الشوكي بعيدا عن المركز بشكل ملحوظ أو ينحرف بأي شكل من الأشكال ، فقم بتقريب خط الوسط باستخدام موضع العملية الشائكة C2 واستقراء ذلك على طول العمود الفقري.
   ملاحظة: قم بتحميل الفيروس في الحاقن عن طريق سحب ~ 5 ميكرولتر على قطعة من البارافيلم ، ووضع الإبرة بحيث يستقر الطرف فوق قطرة الفيروس.
2. بمجرد تحديدها ، ضع الإبرة خلف الصفيحة C5 عند خط الوسط التقريبي واستخدمها كنقطة مرجعية. ثم ، باستخدام أداة المعالجة الدقيقة ، حرك الإبرة بشكل جانبي إلى اليمين بمقدار 0.3 مم. اخفض الإبرة حتى تلامس سطح الحبل الشوكي. من هذا العمق ، اغمر الإبرة 0.6 مم في النخاع الشوكي. إذا لزم الأمر ، استمر في غمر الإبرة حتى تثقب الحبل الشوكي ؛ ثم اسحب الإبرة أو اخفضها إلى العمق المناسب.
3. حقن 1 ميكرولتر من الفيروس المرتبط بالغدة الرجعية 2-scCre بمعدل 250 نانولتر / دقيقة. بعد اكتمال الحقن ، انتظر دقيقتين حتى ينتشر الفيروس في الحبل الشوكي قبل سحب الإبرة ببطء. كرر الحقن باستخدام نفس الإحداثيات الجانبية والعميقة في موقعين آخرين داخل النافذة الشوكية ، أحدهما في منتصف النقطة والأخير أمام الصفيحة T1.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Flexible Needle AttachmentWorld Precision InstrumentsMF34G-5لتنظيف الإبر الزجاجية وتحميل الزيت الأحمر في الإبر الزجاجية.أنابيب الشعرية الزجاجيةأدوات الدقة العالمية4878للإبر الزجاجية المسحوبة - يجب أن تكون مصممة لحاقن النانولتر.معالج دقيق بمقياس ورنيةKanetecN / Aللاستهداف الدقيق أثناء الجراحة.المختبر القياسي أداة التجسيمStoelting51600لتثبيت حامل التقسيم لحديثي الولادة في مكانه Lab Standard with Mouse & Neonates Adapter51615لتثبيت جمجمة حديثي الولادة أثناء جراحة الجمجمة وحقن العمود الفقريمجهر بمقياس الضوء والورنية العينLeitz WetzlarN / Aتستخدم لتصور وقياس شطف الأنابيب الشعرية الزجاجية المسحوبة في إبر زجاجية وظيفية.وحدة تحكم مضخة الحقنالدقيقة العالمية للأدواتالدقيقة 62403للتحكم في معدل الحقن.Nanoliter 2000 حاقن رأس المضخةالعالمية للأدوات الدقيقة500150لتحميل وحقن الفيروس بطريقة خاضعة للرقابة.pAAV-CMV-scCreWu lab Cre البلازميدpAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (البلازميد # 44361) مختبر بريان روث من خلال Addgene DREADD البلازميدPrecisionGlide Needles (25G x 5/8) Becton و Dickinson and Company305122للاستخدام مع المحاقن سعة 1 مل و 10 مل للسماح بحقن النموذج الحيواني.ملقط أسنان الفئرانRobozRS-5152لإمساك العمليات الشائكة.شركة Sterile SalineBaxter HealthcareCorporation 281324للاستخدام في تنقية الدم واستبدال السوائل بعد الجراحة.قفازات جراحيةN / AN / Aللاستخدام من قبل الجراح للحفاظ على المجال المعقم أثناء الجراحة.وسادة التسخين الجراحيةN / AN / Aللحفاظ على درجة حرارة جسم النموذج الحيواني أثناء الجراحة.المجهر الجراحيN / AN / Aلتحسين الرؤية للجرح الجراحي.