$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
- تحضير حقنة الحقن المجهري والحاقن الدقيق للحقن:
- قفل كل حقنة حقن مجهرية محكمة الإغلاق في رف مضخة الحقن المجهري.
- ضع طرف المحقنة المانعة للغاز في الماء المعقم الموجود في قارب وزن صغير ورفرف المكبس برفق لتليين السلك الداخلي. اسحب المكبس بالتساوي إلى مسند المضخة لملئه بالماء.
- حرك أنبوب PE20 المتصل بالحاقن الدقيق على إبرة 26 جم (محور بني) متصلة بحقنة سعة 1 مل مملوءة بالماء المعقم. رش الماء المعقم من خلال الحاقن الدقيق ، وافحص نمط الرش والمسافة.
ملاحظة: يجب أن يرش الماء بعيدا جدا ومباشرة من طرف الحاقن الدقيق. إذا لم يكن التيار مستقيما ، فلن يكون موقع الحقن صحيحا. - ضع الحاقن الدقيق المعقم في حقل معقم.
- حرك الأنبوب من الإبرة ، مع الحفاظ على أنبوب الحاقن الدقيق في وضع مستقيم لمنع الماء من التنقيط مع قطع الأنبوب أسفل المنطقة التي تضررت من الإبرة.
- ادفع مكبس حقنة الحقن المجهري للأمام قليلا لإنشاء قطرة في نهاية الإبرة وحرك أنبوب PE20 المملوء بالماء (المتصل بالحاقن الدقيق) على الإبرة.
ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى إنشاء اتصال من سائل إلى سائل يسمح بالضغط الخلفي المناسب الذي يمكن أن يزيح الانسداد الذي يمكن أن يتشكل عند طرف الحاقن الدقيق. - ادفع المكبس للأمام تماما للتحضير لتحميل العينة والتأكد من عدم وجود أثر للإيثانول في الحاقن الدقيق.
- تحقق من الإعداد بحثا عن التسريبات عن طريق لمس قطرة الماء التي تشكلت عند طرف الحاقن الدقيق إلى مناديل مختبرية نظيفة عدة مرات.
- ملاحظة: عند لمس مناديل المختبر ، يجب أن تتشكل بقعة مبللة واحدة فقط. إذا كان هناك المزيد من القطرات ، فهناك تسرب في النظام.
- تجنب التسريبات عن طريق التحكم في تطبيق الغراء الفائق وتقليم أنبوب PE20 بمقص حاد أو شفرة حلاقة في أي وقت تتم فيه إزالة أنبوب PE20 من أي اتصال.
- اسحب مكبس المحقنة للخلف 0.2 ميكرولتر ؛ مما يؤدي إلى تكوين فقاعة بين الماء المعقم في أنبوب PE20 / الحاقن الدقيق والمحلول المراد حقنه.
- ملاحظة: تمنع هذه الفقاعة تخفيف الحقن وتلوث الماء وتسمح بمراقبة عملية الحقن لأنها ستتحرك أثناء الحقن. يجب إنتاج فقاعة واحدة صلبة.
- ضع الحاقن الدقيق في الكاشف المراد حقنه واسحب مكبس المحقنة ببطء إلى المسند.
- تحضير للحقن:
- أمسك صدر الجرذ على صدر المجريب. نظف المنطقة المحيطة بالقنية باستخدام قضيب قطني مبلل بنسبة 70٪ من الإيثانول (حجم / حجم).
- ملاحظة: من خلال المعالجة الصحيحة ، يمكن تقييد الفئران برفق في يد مقعرة. خلاف ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى التجرف.
- قم بإزالة السدادات باستخدام ملقط صغير وضعها في قارب الوزن الذي يحتوي على 70٪ من الإيثانول (v / v).
- إجراء الحقن:
- ضع الحاقن الدقيق المملوء في القنية. اضغط على Start on Pump Microject وراقب حركة الفقاعات.
- ملاحظة: قد يكون من الضروري تطبيق ضغط خفيف لضمان عدم رفع الحاقنات الدقيقة. يجب أن تتقدم الفقاعة بشكل موحد وتدخل بالكامل في الحاقن الدقيق.
- قم بإزالة الحاقنات الدقيقة من القنية واستبدل السدادات ، بمجرد اكتمال الحقن ومرور فترة الانتشار بعد الحقن.
- ملاحظة: أوقات الانتشار النموذجية بعد الحقن هي 2-4 دقائق للكواشف الدوائية و 2-10 دقائق للفيروسات. إن ترك الحاقن الدقيق خلال فترة ما بعد التسريب يمنع الحقن من الارتجاع مرة أخرى إلى القنيات بدلا من الانتشار في الأنسجة. ضع السدادات على جانب قارب الوزن المملوء بالإيثانول للسماح للإيثانول بالتصريف قبل إعادة إدخاله في القنية.