زرع أسلاف الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية في شرائح قشرية بشرية

الملخص

المصدر: Palma-Tortosa، S.، et.al. الثقافات العضوية للقشرة البشرية البالغة كنموذج خارج الجسم الحي لزرع الخلايا الجذعية البشرية والتحقق من صحتها. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو زرع الخلايا السلفية العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية في شرائح الأنسجة القشرية البشرية. يتضمن الإجراء عزل الخلايا السلفية وإعادة تعليقها في مصفوفة غشاء القاعدية ، متبوعا بحقنها في شريحة قشرية موضوعة على مجموعة عابرة. بعد الحضانة للسماح بتصلب المصفوفة والتمايز العصبي ، يتم تحضير الأنسجة المزروعة لمزيد من التحليل.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. تكاثر وتمايز خلايا lt-NES

ملاحظة: يتم إنشاء الخلايا الجذعية الشبيهة بالظهارة العصبية (lt-NES) طويلة الأمد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستمدة من الخلايا العصبية الظهارية ذاتية التجديد (lt-NES) ونقلها باستخدام ناقل فيروسي يحمل بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) تحت محفز تأسيسي (خلايا GFP-lt-NES). يتم تخزين القوارير التي تحتوي على 3 × 10⁶ خلايا عند -150 درجة مئوية حتى الاستخدام.

1. إعداد حلول المخزون والوسائط

1. قم بتخفيف 100 ميكروغرام من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) في 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) -0.1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) للحصول على تركيز مخزون 10 ميكروغرام / مل. تحضير 100 ميكرولتر من الحصص الصغيرة.

2. خفف 100 ميكروغرام من عامل نمو البشرة (EGF) في 10 مل من PBS-0.1٪ BSA للحصول على تركيز مخزون 10 ميكروغرام / مل. تحضير 100 ميكرولتر من الحصص الصغيرة.

3. ملحق Aliquot 50x B27 بحجم 100 ميكرولتر لكل حصة.

4. خفف 10 ملغ من بولي إل أورنيثين في 100 مل من الماء منزوع الأيونات لتركيز مخزون 100 ميكروغرام/مل. اصنع 1 مل من الحصص الصغيرة.

5. تحضير 30 ميكرولتر من 1.20 ملغم/مل لامينين الفأر.

6. خفف 10 مل من حمض التربسين -إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) (0.25٪) في 90 مل من PBS إلى تركيز مخزون 0.025٪. تحضير 1 مل من الحصص الصغيرة.

7. خفف 0.025 جم من مثبط التربسين في 50 مل من PBS إلى تركيز مخزون قدره 0.5 مجم / مل. تحضير 1 مل من الحصص الصغيرة.

8. خفف 10 ميكروغرام من Wnt3a (عضو عائلة موقع تكامل MMTV من النوع بدون أجنحة 3A) في 1 مل من PBS-0.1٪ BSA للحصول على تركيز مخزون 10 ميكروغرام / مل. تحضير BMP4 (البروتين المورفوجيني للعظام 4) بنفس الطريقة. Aliquot في حجم 100 ميكرولتر.

9. خفف 1 مجم من السيكلوبامين في 2.5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى تركيز نهائي يبلغ 400 ميكروغرام / مل ، وصنع 100 ميكرولتر من الحصص

10. قم بإعداد الوسط الأساسي (الجدول 1) والوسط المحدد للتمايز (DDM ، الجدول 2) ، وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

2. طلاء أطباق الثقافة

< ص النمط = "الهامش الأيسر: 40 بكسل ؛" >1. لطلاء الأطباق مسبقا لزراعة خلايا GFP-It-NES أثناء التكاثر أو التمايز ، قم بتخفيف poly-L-ornithine 1: 100 في الماء منزوع الأيونات وإضافة 5 مل من المحلول إلى قارورة T25. احتضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT).

2. اغسل الألواح المطلية ب poly-L-ornithine 1x بالماء منزوع الأيونات و 1x باستخدام PBS.

3. بالنسبة لخلايا GFP-It-NES في حالة التكاثر ، قم بتخفيف لامينين الماوس عند 1: 500 في PBS واحتضانه لمدة ساعتين على الأقل عند 37 درجة مئوية. بالنسبة لخلايا GFP-It-NES في التمايز ، قم بتخفيف لامينين الفأر عند 1: 100 في PBS واحتضانه لمدة ساعتين على الأقل عند 37 درجة مئوية.

3. انتشار خلايا GFP-lt-NES

1. دافئ 5 مل (للغسيل) و 5 مل (للبذر) من الوسط الأساسي في أنبوبين مختلفين سعة 15 مل.

2. قم بإذابة قارورة واحدة من خلايا GFP-lt-NES بسرعة عند 37 درجة مئوية ، وانقلها إلى أنبوب الغسيل ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.

3. استنشق الوسط بعناية دون لمس الحبيبات وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط الأساسي الدافئ مسبقا. انقل معلق الخلية إلى أنبوب البذر الذي يحتوي على وسط أساسي مكمل بعوامل التكاثر: EGF (10 نانوغرام / مل) ، bFGF (10 نانوغرام / مل) ، و B27 (10 نانوغرام / مل). قم بزرع الخلايا على قارورة T25 المغلفة ب poly-L-ornithine / lamininin.

4. تغذية الخلايا بعوامل التكاثر كل يوم. استبدل الوسط إذا تحول إلى اللون الأصفر. قم بتمرير الخلايا كل يوم ثالث أو رابع (يوم واحد بعد وصولها إلى التقاء 100٪).

4. تقسيم خلايا GFP-lt-NES للتكاثر والتمايز

< p style = 'margin-left: 40px ;'>1. قم بتسخين 5 مل من الوسط الأساسي لكل قارورة (لجمع الخلايا) ، بالإضافة إلى الحجم الإجمالي اللازم لإعادة زرعها.
ملاحظة: يتم المرور بتخفيف 1: 3 للحفاظ على تكاثر الخلايا ، ويتطلب 15 مل من الوسط الأساسي ، وتخفيف 1: 6 لبدء التمايز ، مما يتطلب 30 مل من الوسط الأساسي.

2. قم بإزالة الوسط من قارورة زراعة الخلية عن طريق الشفط وأضف 500 ميكرولتر من 0.025٪ تربسين مسخن مسبقا. احتضن لمدة 5-10 دقائق في RT. يمكن تأكيد انفصال الخلايا تحت مجهر ضوئي قياسي بتكبير 10x.

3. أضف حجما متساويا من مثبط التربسين (0.5 مجم / مل التركيز النهائي) متبوعا ب 5 مل من الوسط الأساسي الدافئ. افصل الخلايا واجمعها عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.

4. للحفاظ على الخلايا في حالة تكاثر ، أعد اللوحة عند تخفيف 1: 3 في وسط أساسي جديد مكمل بعوامل الانتشار ، وكرر الخطوة 1.3.4.

5. التمايز القشري لخلايا GFP-lt-NES

< p style='margin-left: 40px;'>1. في اليوم 0 ، أعد تعليق الخلايا (لاستخدامها للتمايز) في 30 مل من الوسط الأساسي المكمل بعوامل التكاثر ، وقم بوضعها في ستة قوارير T25 مطلية بالتمايز (تقسيم 1: 6).

2. في اليوم 1 ، قم بتغيير نصف الوسيط إلى DDM ، وأضف عوامل الانتشار بنصف تركيزها.

3. في اليوم 2 ، قم بتغيير الوسط تماما إلى DDM المكمل بعوامل التمايز: BMP4 (10 نانوغرام / مل) ، Wnt3a (10 نانوغرام / مل) ، وسيكلوبامين (400 نانوغرام / مل).

4. في اليوم 4، أضف عوامل التمايز وحدها. استبدل الوسط إذا تحول إلى اللون الأصفر.

5. في اليوم 6، قم بتغيير الوسيط إلى DDM المكمل ب BMP4 و Wnt3a. تتم إزالة السيكلوبامين في هذه الخطوة.

6. في اليوم 7، افصل الخلايا كما هو مذكور في الخطوة 1.4.2 والخطوة 1.4.3.

2. زرع خلايا GFP-lt-NES في شرائح hACtx عضوية

ملاحظة: يجب زراعة الأنسجة القشرية البشرية البالغة (hACtx) لمدة أسبوع واحد قبل زرع الخلايا. لتسهيل إجراء الزرع ، من الضروري إزالة 2 مل من وسط hACtx من أعلى الملحق لمنع الأنسجة من الطفو.

1. أعد تعليق خلايا GFP-lt-NES المعدة قشريا (من الخطوة 1.5.6) في مصفوفة غشاء القاعدي النقي البارد (انظر جدول المواد) بتركيز 1 × 105 خلية / ميكرولتر ونقل المحلول إلى أنبوب معقم أصغر.

ملاحظة: أثناء إجراء الزرع ، يجب تبريد جميع المواد (أطراف الماصة ، والأنابيب ، والشعيرات الدموية ، وما إلى ذلك) مسبقا لتجنب تصلب الهلام. قم بإذابة جل مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل استخدامه.

2. اجمع تعليق الخلية في شعرية زجاجية باردة متصلة بحلمة مطاطية للشفط. حقن معلق الخلية على شكل قطرات صغيرة (حوالي 1 ميكرولتر لكل منها) عن طريق طعن شريحة الأنسجة شبه الجافة في مواقع مختلفة.

3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يتجمد الجل. انقل اللوحة من الحاضنة مرة أخرى إلى غطاء المحرك وأضف بعناية 2 مل من وسط hACtx إلى الجزء العلوي من الملحق لغمر الأنسجة تماما.

4. استبدل وسط الاستزراع بوسط hACtx طازج مرة واحدة في الأسبوع.

النتائج

الجدول 1: تكوين وسط التكاثر لخلايا lt-NES (الوسط الأساسي).

< فئة الشكل = نمط "الجدول" = "تعويم: اليسار ؛" >< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'> تركيز المخزون المتوسط الأساسيالتركيزالنهائي لكل 100 ملDMEM / F12 مع L-Glutamine1x 98.7 مل

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ترفيه وثقافة الأنسجة القشرية الحديثة البشرية6 بئر لوحةThermoFisher Scientific140675 Alvetex سقالة 6 إدراج جيدReinnervate LtdAVP004-96 مكمل B27 (50x) ThermoFisher Scientific17504001 BrainPhys بدونتقنيات الخلايا الجذعية الحمراء الفينول # 05791المشار إليه كوسيط عصبي في النصوحدات التصفية 250 مل أو 500 ملCorning SigmaCLS431096/97 ملقطأي جنتاميسين مناسب (50 ملغ / مل) مكمل ThermoFisher Scientific15750037 Glutamax (100x) ThermoFisher Scientific35050061المشار إليه باسم L-glutamine في النصحلمة مطاطية + ماصة زجاجيةأي مناسبة جيل من خلايا lt-NES2-Mercaptoethanol 50 mMThermoFisher Scientific31350010 المؤتلف الخالي من EGFPeprotechAF-100-15 B27 Suplemment (50x) Thermo Fisher Scientific17504001 bFGFPeprotechAF-100-18B الألبومين البقري الجزئي V (محلول 7.5٪) ThermoFisher Scientific15260037 Cyclopamine ، V. كالسيفورنيكومكالبيوكيم # 239803 د (+) محلول الجلوكوز (45٪) سيجماG8769 ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) سيجما ألدريتشD2438-10 مل DMEM / F12ThermoFisher Scientific11320074 محلول ملحي عازل للفوسفات من Dulbecco (DPBS) ثيرمو فيشر العلمي14190-144بدونبروتين فأر لامينين من الكالسيوم والمغنيسيوم ، محاليل الأحماض الأمينية غير الأساسية من Thermo Fisher Scientific 23017015 MEM (100x) مكمل ThermoFisher Scientific11140050 N-2 (100 ×) ThermoFisher Scientific17502001 Poly-L-OrnithineMerkP3655 أنظمة البحث والتطوير للبروتين البشري المؤتلف BMP-4314-BP-010 أنظمة البحث والتطوير البشرية المؤتلفة Wnt-3a5036-WN بيروفات الصوديوم (100 ملم)ThermoFisher Scientific11360070 مثبط التربسين فول الصويا ، مسحوقThermo Fisher Scientific17075029 المياه المعقمة منزوعة الأيوناتنظام تصفيةMilliQ MilliQTrypsin EDTA (0.25٪) SigmaT4049-500ML معدات لزراعة الخلاياماصات حجم قابل للتعديل 10 ، 100 ، 200 ، 1000 ميكرولترEppendorfمصفوفة غشاء القاعدية المختلفة مؤهلة ESC (Matrigel) CorningCLS354277-1EA جهاز طرد مركزيHettich CentrifugenRotina 420R5٪ CO2 ، 37 °CحاضنةThermoForma Steri-Cult CO2HEPA Class100 أداة قطع الخلايا الجذعية 0.190-0.210 ممVitrolife14601 أنابيب معقمةSarstedtماصات باستور زجاجية معقمة مختلفة يمكن التخلص منها 150 ممVWR612-1701 أطراف ماصة معقمة 0.1-1000 ميكرولترBiotix VWR ماصات مصلية معقمة مختلفة 5 ، 10 ، 25 ، 50 ملقوارير CostarT25 مختلفة NuncThermoFisher Scientific156367