مقالة منهجية

الحقن التجسيمي للفيروسات من أجل تعديل جيني مستقر في نموذج الفأر

أغسطس 29, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Porlan، E.، et al. تعديل جيني مستقر وفعال للخلايا في الفأر البالغ V-SVZ لتحليل التأثيرات المستقلة وغير المستقلة للخلايا الجذعية العصبية. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو التعديل الجيني المستقر للخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في المنطقة البطينية تحت البطينية (V-SVZ) من خلال الحقن التجسيمي لجين علاجي يحمل الفيروس في نموذج الفأر. يدخل الفيروس إلى NSCs ، ويخضع للنسخ العكسي ، ويتكامل في الجينوم ، ويتيح التعديل الجيني المستقر والفعال لتطبيقات العلاج العصبي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الحقن التجسيمي للبطين الجانبي (LV) في المنطقة البطينية تحت البطينية (V-SVZ) / حدود المخطط أو في الحقن

  1. المجهري LV من نمط LV
    1. حدد وقم بتعقيم الأدوات اللازمة للجراحة (مشرط ، مثقاب ، وملاقط صغيرة).
    2. تخدير فأر يبلغ من العمر 6-8 أسابيع عن طريق حقن خليط من الكيتامين والميديتوميدين تحت إشراف الطبيب البيطري. قم بوزن كل وجرعة كل منها ب 50-75 مجم من الكيتامين و 0.5-1 مجم ميديتوميدين لكل كيلوغرام من وزن جسم الفأر (حوالي 100-125 ميكرولتر من محلول عمل الكيتامين / الميديتوميدين لكل فأر).
    3. قم بتقييم مستوى التخدير عن طريق الضغط على أصابع القدم أو الذيل أو الأذن والتأكد من عدم ظهور أي رد فعل على.
    4. بمجرد تخدير الفأر ، قم بحقن البوتورفانول تحت الجلد بجرعة نهائية من 0.4-0.5 مجم لكل كيلوغرام من وزن الفأر لتقليل آلام ما بعد الجراحة.
    5. احلق المنطقة الواقعة بين الأذنين وقم بتطهير الجلد باستخدام اليودوفور مثل اليودوبوفيدون أو 70٪ إيثانول. نظف باستخدام أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية. احرص على عدم تبليل بشكل مفرط ، لأن هذا قد يؤدي إلى تفاقم انخفاض حرارة الجسم.
    6. ضع في وضع الانبطاح على إطار تجسيمي وقم بإصلاح الرأس بعناية باستخدام قضبان الأذن ودعم الحنك للجهاز. احتفظ بالماوس مع ضبط وسادة تسخين على 37 درجة مئوية وقم بتطبيق زيوت تشحيم العين على العينين.
    7. قم بعمل شق بطول 1 سم على جلد الرأس طوليا باستخدام مشرط ، واسحب الجلد برفق لكشف الجمجمة باستخدام ملاقط دقيقة.
    8. نظف سطح العظام بعناية باستخدام قضيب معقم برأس قطني. نظف عظم الجمجمة المكشوف من أي أنسجة متبقية.
    9. قم بتركيب المحقنة المعقمة على الجهاز التجسيمي باستخدام حامل المحقنة.
    10. حرك حامل المحقنة على طول المحاور x و y و z حتى يتم وضع طرف إبرة المحقنة على bregma ، وهي نقطة الاقتران حيث تتقاطع الخيط السهمي (الطولي والإنسي) بشكل عمودي بواسطة الخيط الإكليلي (الشكل 1 ب). تأكد من أن الموضع "صفر" للمحور الظهري البطني (DV) يقع على سطح الجمجمة عند بريجما.
    11. انقل المحقنة إلى إحداثيات الوجهة x و y (انظر الجدول 1 والشكل 1 ب).
    12. على إحداثيات الوجهة x و y و z على مقياس Vernier حتى تتمكن من العودة إلى موقع الحقن لاحقا. ضع علامة على العظم عند إحداثيات x و y باستخدام قلم تحديد جراحي.
    13. حرك المحقنة بعيدا عن منطقة العمل.
    14. باستخدام المثقاب الكهربائي ، قم بعمل ثقب في الجمجمة بعناية حتى لا تتلف الدماغ. لا تحفر سطح اللوية ، فقد يؤدي ذلك إلى إتلاف سطح الدماغ.
    15. قم بتحميل المحقنة ب 1 ميكرولتر من المحلول الفيروسي 106 TU / μl (وحدات التحويل لكل ميكرولتر). استخدم إبرة مشطوفة حادة قياس 33 بزاوية طرفها 10-12 درجة. ضع إبرة المحقنة بزاوية 90 درجة فيما يتعلق بسطح الدماغ.
    16. حرك المحقنة مرة أخرى إلى موقع الحقن وحركها لأسفل حتى يلامس الطرف سطح القرباغة.
    17. اخترق الدماغ بالمحقنة إلى إحداثيات z في محور DV.
    18. حرر المعلق الفيروسي ببطء بمعدل 0.2 ميكرولتر / دقيقة لتقليل الضرر الذي يلحق بأنسجة المخ بسبب ضغط السوائل المفرط.
    19. انتظر لمدة 5-10 دقائق لتقليل التدفق العكسي للتعليق الفيروسي ، ثم اسحب المحقنة ببطء شديد.
<فئة الشكل = نمط الجدول: "الطفو: اليسار ؛ العرض: 100٪ ؛ ><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>< نمط العمود = 'العرض: 25٪ ؛ '>< نمط عمود = 'العرض: 25٪ ؛ '>< نمط العمود = 'العرض: 25٪ ؛'>منطقة الحقنإحداثياتالأمامية الخلفية (AP) المتوسطة الجانبية (ML) الظهرية البطنية (DV)SEZ / حدود المخطط + 0.6 مم + 1.2 مم - 3.0 ممالبطين الجانبي - 0.3 مم + 1.0 مم - 2.6 مم




الجدول 1: الإحداثيات التجسيمية للحقن. بالنسبة للمحاور الأمامية الخلفية (AP) والمتوسطة الجانبية (ML) ، يتم إعطاء إحداثيات x و y كمسافة (بالمليمتر) من البريجما. يشير "-" إلى "نحو الخلف". بالنسبة لإحداثيات DV ، فإن "الصفر" هو سطح الجمجمة عند نقطة بريجما ، وتشير إحداثيات DV إلى المسافة (بالمليمتر) لأسفل من هذه النقطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فئة الشكل ='image image-style-align-center image_resized' style='display:table;margin-left;auto;margin-right:auto;width:75٪;'>figure-results-1

الشكل 1: تمثيل تخطيطي للأجزاء المختلفة من الإجراء. (أ) توليد LVs لدراسات الوسم في الجسم الحي، بدءا من تعدي خلايا الكلى الجنينية البشرية 293T (HEK293T) مع البلازميدات المناسبة لتوليد LVs، إلى تحديد عيار الفيروس عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الصيغة المش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المعدات: Vernier أداة التجسيميةNeuroLab ، Leica39463001 حامل حقنةKD ScientificKDS-311-CE 33 مقياس حقنةهاميلتونP / N 84851 / 0085RNمثقاب كهربائيأداة العلوم الدقيقة98096 بطانية حراريةUfesaAL5512 / 01230-240 فولت ، 100-110 واط ، نوع C-AL01ماكينة حلاقةجاتاMP373Nالموديل: جمال ، 3 فولت ، 300 مللي أمبير ، نوع HT-03. الكواشف: محلول MedetomidineEsteveDomtorComercial عند 1 مجم / مل.الكيتامينميريالإيمالجينز 500محلول علاجي بمقدار 50 مجم / ملخليط ميديتوميدينا / كيتامين تحضير خليط عامل من ميديتوميدين بتركيز نهائي 0.2 مجم / مل مخفف والكيتامين بتركيز نهائي 15 مجم / مل في محلول ملحي. يستخدم كتخدير بحقن حجم للحصول على تركيز نهائي من 0.5-1 مجم ميديتوميدينا لكل كيلوغرام من وزن الجسم و 50-75 مجم كيتامين لكل كيلوغرام من وزنالجسم بوتورفانولفايزر محلول توربوجيسيكبمعدل 10 مجم / مل. يستخدم كمسكن عند 1 مجم / مل في محلول ملحي.محلول ملحي 0.9٪براون13465412 قلم تحديد جراحيStaedler313-9زيوت تشحيم عيون Lumocolor دائمة Siccafluid0.5 جم / dosis ، كربومر 974Pبوفيدون اليودبيتادين694109.610٪ بوفيدون اليود

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة