التلاعب بخلايا الصفيحة العصبية من خلال الحقن النانوي في الرحم في نموذج فأر جنيني

الملخص

المصدر: Mangold، K.، H el. al.، استهداف الصفيحة العصبية الفئران بواسطة الحقن النانوي في الرحم (NEPTUNE) في اليوم الجنيني 7.5. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو طريقة حقن النانو داخل الرحم لاستهداف الصفيحة العصبية في نموذج فأر جنيني. يتم حقن محلول عدسي عالي العيار في التجويف الأمنيوسي ، حيث يندمج في خلايا الصفيحة العصبية ، مما يتيح معالجة جينية مستقرة لأبحاث النمو العصبي والتطبيقات العلاجية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الحقن

ملاحظة: يتم تعقيم جميع الأدوات المستخدمة في هذا الإجراء قبل الجراحة وبين كل فأر.

1. تخدير الأنثى الأولى ذات تجاويف الحجم المثالي.
2. ضع الأنثى وثبت على الطاولة.
3. ضع جل العين على العينين لمنع جفاف القرنية وحقن المسكنات تحت الجلد.
   ملاحظة: المسكنات الموصى بها: بوبرينورفين (0.05-0.1 مجم / كجم من وزن الجسم) أو فلونكسين (2.5 مجم / كجم) أو ما شابه ذلك وفقا للوائح الرفق بالحيوان المحلية. يتم الحفاظ على التسكين متعدد الوسائط في الفترة المحيطة بالجراحة مع المسكنات المحقونة والأيزوفلوران.
4. قم بإعداد أسفل البطن بشكل معقم عن طريق المسح بقطعة قماش مبللة بمحلول الكلورهيكسيدين 0.5 مجم / مل (أو ما شابه) وتجفيف الجلد. استخدم مقصا جراحيا لعمل شق عمودي في خط الوسط بطول 1.5-2.0 سم في أسفل البطن.
   ملاحظة: جهز المنطقة الجراحية باتباع إجراءات التطهير المعتمدة محليا.
5. ارفع الجلد برفق وحرر الجلد من الطبقة العضلية الأساسية ، حوالي 1 سم حول نقطة الشق ، لتسهيل الخياطة بعد الجراحة.
6. قم بعمل شق عمودي في خط الوسط بطول 1 سم في طبقة العضلات.
7. باستخدام زوج من الملقط ، ارفع جانبا واحدا من الجلد وطبقة العضلات ، ومع الزوج الآخر ، ابحث عن قرون الرحم.
   ملاحظة: يتم ترتيب القطعيات مثل الخرز على قلادة ، في حين أن الأمعاء عبارة عن أنبوب طويل ومستمر (الشكل 1 أ).
8. باستخدام الملقط ، اسحب قرني الرحم بعناية من البطن. امسك الأنسجة بين الأجنة. لا تضغط عليهم مباشرة (الشكل 1 ب).
   ملاحظة: يتم توصيل الرحم بالجسم عند عنق الرحم ، ويتم توصيل المبيضين / قنوات البيض عبر الأربطة. لا تسحب / تفصل الرحم عن نقاط التثبيت هذه.
9. عد وقم بتدوين عدد الأجنة على الجانبين الأيسر والأيمن.
10. قم بترقيم الأجنة إما من المبيض إلى عنق الرحم أو من عنق الرحم إلى المبيض.
    ملاحظة: هذا مهم بشكل خاص إذا تم جمع الأجنة المحقونة في المراحل الجنينية.
11. باستخدام قطعة قطن مبللة ، ادفع جميع الأجنة برفق إلى تجويف البطن باستثناء الثلاثة الأولى التي يتم حقنها.
12. ضع قطرة من PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) على الشريط المطاطي في طبق بتري واحتفظ به مباشرة فوق الأجنة.
13. أدخل ملقطا مغلقا في شق الشريط المطاطي وحرر الملقط لفتح الشق المرن حتى يسقط السائل على الأجنة.
    ملاحظة: هذا يضمن ترطيب الأجنة وأن الغشاء المرن يلتصق بالجلد الرطب للأنثى ، مما يمنع تسرب PBS في الخطوات التالية.
14. اسحب جزءا من الرحم ، يتوافق مع ثلاثة أجنة ، من خلال المرونة باستخدام ملقط ، وقم بوضع طبق بتري برفق على بطن الأنثى.
15. باستخدام الملقط وقطعة قطن رطبة ، اضبط موضع الرحم والمرونة للتأكد من أن الشريط المطاطي مغلق على جلد الأنثى لمنع تسرب PBS.
16. استخدم الأقدام الطينية الأربعة لتأمين وربط طبق بتري فوق البطن مباشرة ، مما يقلل الضغط على الأنثى وحساسية التصوير لتنفس وضربات قلب الأنثى.
17. اضغط على أسطوانة طين النمذجة لأسفل إلى يمين الأجنة / الرحم لتثبيت الرحم (الشكل 1C).
    ملاحظة: تفترض تعليمات التوجيه هذه أن الإبرة على يسار الأنثى وأن أجنة قرن الرحم الأيسر للإناث مكشوفة. يعد جانب الرحم (قرن الرحم الأيسر أو الأيمن) أمرا بالغ الأهمية لأن السائل الأمنيوسي (AC) إما يواجه الإبرة (القرن الأيسر. الشكل 1 د) أو يواجه أسطوانة الطين المثبتة (القرن الأيمن ؛ الشكل 1 ه).
18. لحقن الأجنة من قرن الرحم الأيمن ، ضع الأسطوانة الطينية على الجانب الأيسر من الأجنة (الشكل 1F) وأدر طاولة التسخين 180 درجة (الشكل 1G) لتحقيق الاتجاه الصحيح. إذا كان من الممكن تحريك الإبرة بدلا من ذلك ، فقم بالتكيف حسب الملاءمة للإعداد ذي الصلة.
19. أضف PBS إلى طبق بتري حتى يتم تغطية الأجنة والرحم ب PBS.
20. قم بخفض مسبار الموجات فوق الصوتية في PBS واضبط طاولة الفأر / الجراحة بحيث يتم محاذاة الجنين الأول مع مسبار الموجات فوق الصوتية لتسهيل تسجيل الحقن.
    ملاحظة: يشير مصطلح "أولا" إلى ترقيم الأجنة من المبيض إلى عنق الرحم.
21. افحص الأجنة الثلاثة وافحص مكيفات التيار المتردد. حدد حجم الحقن على النحو التالي:
    1. قياس قطر التيار المتردد بجهاز الموجات فوق الصوتية. حقن 69 نانولتر إذا كان قطر التيار المتردد ≤0.2 مم ؛ حقن 2 × 69 نانولتر (= 138 نانولتر) إذا كان قطر التيار المتردد >0.2 مم و ≤0.29 مم ؛ وحقن 3 × 69 نانولتر (= 207 نانولتر) إذا كان قطر التيار المتردد > 0.29 مم (الشكل 1H).
       >ملاحظة: أظهرت التجارب السابقة أن ما يصل إلى 207 حجم حقن لتر يمكن تحمله جيدا عند E7.5. يتم تحقيق الحقن الناجح مع الحد الأدنى من التأثير على البقاء على قيد الحياة عندما لا تتجاوز الزيادة النسبية في الحجم للتيار المتردد 90٪. يعد الاختلاف في حجم التيار المتردد بين زملاء القمامة أو سلالات الفئران أمرا شائعا وقد يتطلب مزيدا من التحسين.
22. اضبط أحجام الحقن باستخدام وحدة التحكم في الحقن.
23. اضبط سرعة الحقن على إبطاء بمعدل حقن يبلغ 23 nL / s.
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي نماذج المعدات المختلفة إلى قوى حقن مختلفة.
24. اخفض الإبرة في PBS باستخدام العجلات الرئيسية على نظام السكك الحديدية (المستويات x و z ، الشكل 1I) واضغط على إفراغ على وحدة التحكم في الحاقن النانوي حتى يصل السائل إلى طرف الإبرة.
    ملاحظة: إذا كانت الإبرة مسدودة ، فإن الضغط على فارغ يمكن أن يؤدي إلى إذابة الانسداد و / أو طرد السدادة.
25. ارفع الإبرة من PBS واضغط على حقن. تحقق من تفريغ انخفاض وحدة التخزين التقريبية المطلوبة.
26. قم بخفض الإبرة في PBS وقم بمحاذاة المسبار بالموجات فوق الصوتية والجنين عن طريق تحريك الحاقن النانوي بعجلة المستوى y على المعالج الدقيق (الشكل 1J).
    ملاحظة: يتم محاذاة طرف الإبرة تماما عندما يظهر كنقطة مضيئة على صورة الموجات فوق الصوتية (الشكل 1K ، L). يمكن تحريك الإبرة في جميع مستويات الاتجاه الثلاثة باستخدام أداة المعالجة الدقيقة.
27. اضبط زاوية الإبرة باستخدام عجلة زاوية الحقن لضمان زاوية الحقن شبه العمودية بالنسبة لجدار الرحم. أدخل الإبرة في التيار المتردد بحركة واحدة باستخدام عجلة الحقن على المعالج الدقيق (الشكل 1J-M). راقب سطوع طرف الإبرة. إذا اختفى طرف الإبرة من صورة الموجات فوق الصوتية ، فحرك مسبار الموجات فوق الصوتية للأمام أو للخلف لإعادة الإبرة إلى التركيز البؤري.
    ملاحظة: بمجرد أن تكون الإبرة داخل مكيف الهواء ، يمكن إجراء تعديلات طفيفة على موضع الإبرة والتركيز دون الإضرار بالجنين (التعديلات في حدود ~ 0.3 مم). لا تضبط موضع الإبرة أكثر من هذا.
28. اضغط على الحقن (ل 207 nL ، اضبط مستوى الصوت على 69 nL ، وحقن ثلاث مرات). بعد الحقن ، انتظر 5-10 ثوان إضافية قبل سحب الإبرة بحركة واحدة لطيفة.
29. انقل المرحلة إلى الجنين التالي وكرر الخطوات 1.22-1.26 للجنينين الآخرين إذا كان لديهما أحجام تيار متردد مناسبة.
30. ارفع مسبار الموجات فوق الصوتية والإبرة من PBS باستخدام أداة المعالجة الدقيقة. أدر الإبرة بعيدا عن المشغل لتجنب التلف والإصابة.
31. باستخدام الملقط ، قم بتوجيه الأجنة الأولى والثانية مرة أخرى إلى بطن الأنثى عن طريق دفعها برفق من خلال الشريط المطاطي. أمسك الأنسجة المجاورة للجنين الثالث برفق واسحب الرحم باتجاه الطرف العلوي من الشق المرن. اسحب الأجنة 4-6 برفق باستخدام ملقط واسمح للجنين الثالث بالدخول مرة أخرى إلى البطن.
    ملاحظة: يمكن القيام بهذه الخطوة دون تغيير PBS أو إزالة طبق بتري.
32. كرر حسب الحاجة حتى يتم حقن جميع الأجنة ذات المكيفات المثلى أو الوصول إلى الحد الزمني.
33. ادفع الأجنة / الرحم برفق إلى بطن الأنثى.
34. استنشق PBS وقم بإزالة طبق بتري. إذا تم استخدام فيروس ، فتعامل معه كنفايات معدية.
35. قم بخياطة الطبقة العضلية معا باستخدام Vicryl (USP 6-0 ، طول الإبرة 13 مم ، 3/8 دائرة) في خيوط بسيطة مستمرة أو متقطعة وأغلق الجلد ب 1-2 مقاطع (انظر جدول المواد).
36. قم بإيقاف تشغيل مضخة الأيزوفلوران.
37. قم بإزالة الشريط الجراحي وضع الأنثى في وضع الانبطاح (البطن لأسفل) في قفص نظيف على لوحة تسخين 40 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المتوقع أن تستعيد الأنثى وعيها وتكون متحركة في غضون 10 دقائق. تأكد من اكتمال الإجراء في غضون 30 دقيقة. قد تؤثر الخلفية الجينية والعمر والوزن للإناث على الحساسية للتخدير. راقب الفئران أثناء الجراحة بحثا عن علامات بطء التنفس (التنفس البطيء يعني أن التخدير عميق جدا) أو الحركة (التخدير خفيف جدا). يمكن توفير البوبرينورفين (0.05-0.1 مجم / كجم من وزن الجسم) أو Flunixin (2.5 مجم / كجم) أو ما شابه ذلك ، وفقا للوائح الرفق بالحيوان المحلية ، بعد 8 ساعات من الحقن الأول إذا لزم الأمر.
38. إذا كان سيتم حقن أنثى أخرى ، فقم بإعداد المنطقة الجراحية أثناء مراقبة استيقاظ الأنثى الأولى.
    1. امسح الأدوات الجراحية بنسبة 70٪ من الإيثانول لإزالة أي دم أو أنسجة متبقية وتعقيمها في معقم الخرز الزجاجي المسخن مسبقا لمدة 10 ثوان ، تخلص من مسحات القطن واستخدم المناديل الورقية. امسح طبق بتري وقطع الطين حتى تجف بالمناديل الورقية.
39. كرر الخطوات 1.1-1.35 حتى يتم حقن جميع الإناث.
40. أفرغ الإبرة وتخلص منها.
    1. إذا كان هناك فيروس أو محلول حقن متبقي في الإبرة، فاضغط على إفراغ على حاقن النانو وأفرغ محتوى الإبرة على المناديل الورقية.
    2. اسحب المكبس المعدني تماما بالضغط على Fill حتى يكون هناك صوت تنبيه مزدوج من وحدة التحكم ، مما يشير إلى أن المكبس قد تم سحبه تماما.
    قم
    3. بفك الكوليت وحرك الإبرة من المكبس المعدني. تخلص من الإبرة في حاوية نفايات الأدوات الحادة.
41. قم بتنظيف مقعد BSL-2 (السلامة البيولوجية المستوى 2).
    1. إذا تم استخدام فيروس ، فقم برش المجال الجراحي بأكمله بمطهر (انظر جدول المواد). بعد 15 دقيقة ، امسح المطهر ونظف المجال الجراحي بالكامل بنسبة 70٪ من الإيثانول. إذا لم يتم استخدام أي فيروس ، فقم بتنظيف جميع الأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول.
    2. امسح أي PBS متبقي من مسبار الموجات فوق الصوتية باستخدام مناديل ورقية جافة وناعمة وخالية من النسالة.
42. تخلص من النفايات وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية.
43. قم بإيقاف تشغيل جهاز الموجات فوق الصوتية ، وطاولة التسخين ، ومقعد BSL2 ، وإمداد O₂.

النتائج

فئة الشكل = 'image image-style-align-center image_resized' style = 'display: table ؛ margin-left: auto ؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: الحجم الأمثل والاتجاه للتجويف الأمنيوسي للحقن الناجح. (أ) قرن الرحم مع العديد من E7.5 deciduas ، على شكل سلسلة من الكرات (أسفل) مقارنة بالأمعاء الغليظة (أعلى). (ب) أمسك أنسجة الرحم (...

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1 مل حقنةBD Bioscience309628 27 G إبرةBD Bioscience300635 3.5 بوصة الشعيرات الدمويةDrummond Scientific3000203G / Xتم استخدامها لسحب الإبر المنزلية70 ميجا هرتز MS سلسلة محولVisual SonicsMS700 Aquasonic واضح بالموجات فوق الصوتية جلباركر مختبراتMar-50 Autoclip Applier 9 ممAngthos12020-09 CD1 الفئرانتشارلز ريفر ، ألمانياCrl: CD1 (ICR) الإناث: من عمر 8 أسابيعالذكور: من عمر 12 أسبوعامسحة قطنOneMed Sverige AB120788 DPBSGibco14190094 ملقط ضمادة مستقيم دقيق 13 سمAgnthos08-032-130 EZ clips 9 ممAngthos59027Clipsمقص قزحية ، سوبر كت ، مستقيم ، 9 سمAgnthos307-336-090 IsofluoraneBaxter Medical ABEAN: تم شراؤها 50085412586613من الصيدلية السويديةKimwipesKimberly Clarke7557 Membrane TapeVisual SonicsSA-11053 Micropipette PullerSutter InstrumentP-97 نمذجة ClaySense AB10209 طاولة مناولة الماوسVisual Sonics50249 طقم حاقن السيارات Nanoject IIDrummond3-000-205A ParafilmBemisHS234526C طبق بتري مع فتحة مركزية (جدار منخفض)طبق بتري Visual SonicsSA-11620 ، (ØxH): 92 × 16 ممSarstedt82.1472.001 Rely + On VirkonDuPontمطهر 130000132037غشاء سيليكونVisual SonicsSA-11054 Steri 250 ، معقم بالخرز الساخنAngthos31100 شريط جراحي (1.25 سم × 9.14 م)Medicarrier67034 Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) نظام التخديرVisual SonicsVS-12055 Vevo محطة التصوير 2Visual SonicsVS-11983 Vevo2100Visual SonicsVS-20047 Vicryl 6-0 ؛ إبرة C-3 ، خيوط أرجوانية 45 سمAgnthosJ384H