نقل الجينات إلى خلايا شوان في العصب الوركي القوارض عن طريق التثقيب الكهربائي

الملخص

المصدر: Ino، D. et al.، في الجسم الحي نقل الجينات إلى خلايا شوان في العصب الوركي القوارض عن طريق التثقيب الكهربائي. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو نقل الجينات في الجسم الحي إلى خلايا شوان في العصب الوركي القوارض باستخدام التثقيب الكهربائي. يتم حقن محلول صبغة الحمض النووي البلازميد في العصب ، وتسهل النبضات الكهربائية دخول الحمض النووي. يندمج الحمض النووي لاحقا في جينوم الخلية ، مما يتيح نقل الجينات بنجاح في خلايا شوان.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير الحمض النووي البلازميدي

1. قم بإنشاء بلازميدات الحمض النووي للتثقيب الكهربائي في الجسم الحي عن طريق استنساخ الحمض النووي التكميلي (cDNA) أو تسلسل الحمض النووي الريبي القصير (shRNA) في بلازميد تعبير لخلايا الثدييات. استخدم محسن مبكر فوري للفيروس المضخم للخلايا وبلازميد يدرك بمحفز β-أكتين للدجاج (CAG) لأنه يسمح بتعبير قوي ومستقر. للتعبير عن shRNAs تحت سيطرة محفز CAG ، استخدم نظام كاسيت shRNA المستند إلى mir30 لاستنساخ shRNA الفرعي.
2. قم بتنقية الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة أدوات التحضير الماكسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وأعد تعليق الحمض النووي باستخدام محلول ملحي مخزن ب HEPES (140 ملي كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ، 0.75 ملي فوسفات هيدروجين ثنائي الصوديوم ، Na₂HPO₄ ، 25 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) ؛ درجة الحموضة 7.40). اضبط تركيز الحمض النووي على ≥4 ميكروغرام / ميكرولتر.
3. قم بإعداد محلول الحمض النووي البلازميد بتركيز 4 ميكروغرام / ميكرولتر ، وأضف كمية قليلة من الصبغة الخضراء السريعة (التركيز النهائي 0.01٪) لتسمية موقع الحقن. عندما تكون هناك حاجة إلى التثقيب الكهربائي المتزامن لبلازميدات متعددة ، اضبط التركيز الكلي لمحلول الحمض النووي البلازميد إلى 4 ميكروغرام / ميكرولتر.
   ملاحظة: يجب تحديد التركيب الأمثل للحمض النووي البلازميد وفقا لكفاءة التعدي لكل بلازميد.

2. تعقيم الأدوات الجراحية والأدوات

1. الجراحية الأوتوكلاف المالحة ومحلول كلوريد الصوديوم 0.9٪.

3. تحضير الماصات الزجاجية الدقيقة

1. سحب الماصات الزجاجية باستخدام مجتذب الماصة. قطع طرف الماصة إلى قطر 30-50 ميكرومتر. استخدم المعلمات التالية: الحرارة ، 600 ؛ السرعة ، 50 ؛ زمن ، 75.

4. جراحة وحقن الحمض النووي والتثقيب الكهربائي

ملاحظة: نظرة عامة على هذه الخطوة موصوفة في الشكل 1. على الرغم من وصف الإجراء الخاص بجراء الفئران هنا ، إلا أن الطريقة قابلة للتطبيق أيضا على الأكثر نضجا باستخدام نفس الإجراء.

1. قم بتخدير الجرذ باستخدام الأيزوفلوران في صندوق الحث حتى يصبح غير متحرك عن طريق ضبط تدفق الأكسجين إلى 0.4 لتر / دقيقة وتركيز الأيزوفلوران إلى 4٪ (حجم / حجم). قم بإجراء قرص إصبع القدم لتأكيد التخدير المناسب.
2. ضع الجرذ على جهاز تسخين مسخن مسبقا تحت مجهر مجهر وحافظ على التخدير عن طريق إعطاء الأيزوفلوران باستمرار من خلال قناع الوجه. اضبط تدفق الأكسجين على 0.2 لتر / دقيقة وتركيز الأيزوفلوران إلى 2٪ (vol / vol). استخدم قطرات العين لمنع جفاف العينين إذا كانت عيون مفتوحة.
3. إصلاح الساقين مع الشريط الجراحي.
4. نظف الجلد على الفخذ الخلفي باستخدام بوفيدون اليود وقم بعمل شق بمشرط
   ملاحظة: حلق المناطق الجراحية إذا كانت مغطاة بالشعر.
5. كشف العصب الوركي عن طريق إنشاء فتحة بين العضلة الفخذية والعضلة ذات الرأسين الفخذية مع إبر الخياطة.
6. بلل العصب بمحلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪. امتصاص الماء الزائد بورق خال من النسالة.
7. أدخل قاعدة الماصة الدقيقة الزجاجية على أنبوب مرن، واملأ الكمية الكافية من محلول الحمض النووي (ميكرولتر واحد على الأقل) في الماصة الدقيقة عن طريق الشفط برفق.
8. ارفع العصب المكشوف عن طريق سحب الجانب البعيد من العصب برفق باستخدام إبرة.
   ملاحظة: لا تضع توترا على العصب لتقليل الضغط الميكانيكي.
9. أدخل الماصة الدقيقة الزجاجية في الموقع البعيد على العصب، وحقن محلول الحمض النووي عن طريق الضغط (أي عن طريق النفخ في الطرف المفتوح للأنبوب المرن). حقن محلول الحمض النووي حتى يظهر العصب باللون الأخضر (1 ميكرولتر كحد أقصى). نظرا لأن الإدخال المتكرر للماصة الدقيقة يمكن أن يؤدي إلى تلف العصب، فلا تقم بإدخال الماصة الدقيقة أكثر من مرتين.
10. ضع قطبا كهربائيا من البلاتين من نوع الملقط على بعد حوالي 1-2 مم عن العصب. املأ الفجوة بين القطب الكهربائي والعصب بمحلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪.
    ملاحظة: لا تمسك العصب بالقطب لتجنب الضغط الميكانيكي على العصب.
11. ضع نبضات كهربائية على موقع الحقن باستخدام جهاز كهربائي مع القطب. بعد ضبط النبض الأول ، اقلب القطب وقم بتطبيق مجموعة نبضات أخرى. استخدم المعلمات التالية: الجهد ، 50 فولت ؛ مدة النبض ، 5 مللي ثانية ؛ الفاصل الزمني للنبض ، 100 مللي ثانية ؛ رقم النبض 4 مرات.
12. نظف موقع التثقيب الكهربائي بمحلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪.

5. بعد التثقيب

1. الكهربائي أغلق الشقوق بغراء سيانواكريلات.
2. بعد تجفيف الغراء ، نظف الجرح باستخدام بوفيدون اليود.
3. حرر الجرو من قناع الوجه. قم بتسخين الجرو على جهاز تسخين لمدة ساعة على الأقل للسماح له بالتعافي تماما من التخدير.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image-style-align-center image_resized' style='display: table؛ margin-left؛ auto؛ margin-right: auto؛ width: 75٪;'>

الشكل 1: تخطيطي لطريقة التثقيب الكهربائي في الجسم الحي. أولا ، يتعرض العصب الوركي للفأر المخدر. ثانيا ، يتم حقن الحمض النووي البلازميد في العصب الوركي. ثالثا ، يتم توصيل النبضات الكهربائية إلى موقع الحقن من خلال القطب الكهربائي على شكل ملقط. أخيرا ،...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Genopure plasmid Maxi kitRoche03 143 422 001طقم تنقية الحمض النووي البلازميد Fast Green CFCWAKO069-00032صبغة لحقن الحمض النوويGC 150T-10HARVARD DEVICE30-0062زجاج أنابيب الشفط الشعريةDrummond05-2000-00أنابيب الشفط للحقن الصغيرنموذج P-97SUTTER INSTRUMENT CO.مجتذب الماصات الدقيقة CUY21 أحادي الخليةBEXElectroporator CUY21مولد نبضأحادي الخلية جهاز تسخين كهربائيKODENCAH-6Aأكثر تدفئة أثناء الجراحةIsofluolaneMylan1119701G1076مخدر