التوصيل المستدام لعامل نمو الأعصاب باستخدام فيلم سيليكون مسامي في ورم قواتم الفئران 12 خلية

الملخص

المصدر: روزنبرغ، م.، وآخرون. تصميم أغشية السيليكون المسامية كناقلات لعامل نمو الأعصاب. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو استخدام فيلم سيليكون مسامي نانوي قابل للتحلل (PSi) للإفراج المستمر عن عامل نمو الأعصاب (NGF) لدعم تمايز خلايا PC12. يتم امتصاص NGF على مسام الفيلم من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية ويتم إطلاقه تدريجيا في الوسائط عن طريق الانتشار وتدهور السقالة. يعزز هذا التسليم المتحكم فيه بقاء خلايا PC12 ويسهل نمو الخلايا العصبية والتفرع على مدى فترة طويلة.

البروتوكول

1. تصنيع السيليكون المسامي المؤكسد (PSiO₂) الناقلات

1. قطع رقاقة السيليكون (Si) (جانب واحد مصقول على وجه <100> ومخدر بشدة بالبورون ، من النوع p ، 0.95 mΩ · سم) إلى عينات 1.5 سم × 1.5 سم باستخدام قلم ذو رأس ماسي.
2. أكسدة عينات Si في فرن أنبوبي عند 400 درجة مئوية لمدة ساعتين في الهواء المحيط (معدل التسخين: 25 درجة مئوية / دقيقة ، تبريد طبيعي).
3. اغمر عينات Si في محلول من حمض الهيدروفلوريك المائي (HF) (48٪) ، والماء المقطر المزدوج (ddH₂O) ، والإيثانول (99.9٪) (1: 1: 3 v / v / v) لمدة 5 دقائق ؛ ثم اشطف العينات بالإيثانول ثلاث مرات وجففها تحت تيار النيتروجين.
   ملاحظة: قم بإعداد وتخزين محلول HF في الأواني البلاستيكية فقط ، حيث يذوب HF الزجاج.
   CAUTIONHF هو سائل شديد التآكل ، ويجب التعامل معه بحذر شديد.: في حالة التعرض ، اشطفها جيدا بالماء وعالج المنطقة المصابة بهلام ترياق HF ؛ اطلب الرعاية الطبية على الفور.
4. قم بتركيب عينة Si في خلية نقش بولي تترافلورو إيثيلين ، باستخدام شريط من رقائق الألومنيوم كاتصال خلفي ولفائف بلاتينية كقطب مضاد.
5. حفر طبقة قرابين في محلول 3: 1 (v / v) من HF المائي والإيثانول (99.9٪) لمدة 30 ثانية بكثافة تيار ثابتة تبلغ 250 مللي أمبير / سم² ؛ ثم اشطف سطح فيلم PSI الناتج بالإيثانول ثلاث مرات وجففه تحت تيار النيتروجين.
6. قم بإذابة الطبقة المسامية المحفورة حديثا في محلول هيدروكسيد الصوديوم المائي (0.1 متر) لمدة دقيقتين. ثم اشطفه بالإيثانول ثلاث مرات وجففه تحت تيار النيتروجين.
7. اغمر العينة في محلول HF مائي (48٪) ، ddH₂O ، والإيثانول (99.9٪) (1: 1: 3 v / v) لمدة دقيقتين. ثم اشطفه بالإيثانول ثلاث مرات وجففه تحت تيار النيتروجين.
8. حفر عينة Si كهروكيميائيا في محلول 3: 1 (v / v) من HF المائي والإيثانول (99.9٪) لمدة 20 ثانية بكثافة تيار ثابتة تبلغ 250 مللي أمبير / سم² ؛ ثم اشطف سطح فيلم PSI الناتج بالإيثانول ثلاث مرات وجففه تحت تيار النيتروجين.
9. أكسدة عينات PSi المحفورة حديثا حراريا في فرن أنبوبي عند 800 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في الهواء المحيط (معدل التسخين: 25 درجة مئوية / دقيقة ، تبريد طبيعي) لتشكيل سقالة SiO₂ (PSiO₂) مسامية.
قم
10. بتدوير عينات PSiO₂ بمقاومة ضوئية سميكة موجبة عند 4,000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة ؛ ثم اخبز العينات المطلية عند 90 درجة مئوية لمدة دقيقتين (معدل التسخين: 5 درجات مئوية / دقيقة ، تبريد طبيعي).
11. قم بتقطيع عينات PSiO₂ إلى عينات مقاس 8 مم × 8 مم باستخدام منشار تقطيع.
12. لإزالة المقاومة الضوئية ، انقع العينات المقطعة في الأسيتون لمدة 3 ساعات ؛ ثم اشطفها جيدا بالإيثانول وجففها تحت تيار النيتروجين.

2. تحميل PSiO₂ بعامل نمو الأعصاب (NGF) لتحضير

1. محلول تحميل NGF ، قم بإذابة 20 ميكروغرام من الفئران β-NGF في 400 ميكرولتر من محلول 1: 1 (حجم / حجم) من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.01 M (PBS) و ddH₂O.
2. أضف 52 ميكرولتر من محلول التحميل فوق عينة PSiO₂ واحتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT) في طبق مغطى.
   ملاحظة: حافظ على رطوبة عالية في الطبق لمنع المحلول من الجفاف أثناء الحضانة.
3. اجمع المحلول أعلى العينة للقياس الكمي اللاحق لمحتوى NGF داخل حامل PSiO₂.
   NOTE: يجب إجراء تحميل NGF في PSiO₂ مباشرة قبل الاستخدام المقصود ؛ لا يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا بسبب خطر جفاف البروتين وتمسخه.

3. الجدوى الخلية والنمو في وجود NGF المحملة PSiO₂ الناقلات

1. ورم القواتوم الفئران (PC12) ثقافة الخلية< نمط رأ = 'نوع نمط القائمة:عشري;'>
2. إعداد وسط النمو الأساسي عن طريق إضافة 10٪ مصل الحصان (النظام المنسق), 5٪ مصل الأبقار الجنين (FBS), 1٪ لام-الجلوتامين, 1٪ البنسلين الستربتومايسين, و 0.2٪ الأمفوتريسين إلى معهد كركديه بارك الطبي (RPMI) متوسط.
3. قم بإعداد وسيط تمايز بإضافة 1٪ HS و 1٪ L-glutamine و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 0.2٪ أمفوتريسين إلى وسط RPMI.
4. قم بزراعة معلق الخلية (10⁶ خلايا) في قارورة مزرعة مقاس 75 سم² مع 10 مل من وسط النمو الأساسي لمدة 8 أيام ؛ كل يومين ، أضف 10 مل من وسط النمو الأساسي إلى القارورة.
5. لتوليد ثقافة خلايا PC12 متمايزة ، انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي ؛ خلايا الطرد المركزي لمدة 8 دقائق عند 200 × جم و RT. تخلص من المادة الطافية.
6. قم بتعليق الخلايا في 5 مل من وسط النمو الأساسي الطازج وأعد الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 200 × جم و RT ؛ تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 3 مل من وسط النمو الأساسي.
7. لفصل مجموعات الخلايا ، قم بشفط الخلايا عشر مرات باستخدام حقنة 23 G.
8. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا مقياس الدم وبذرة 10⁴ خلايا / سم² منطقة عمل على ألواح مغلفة بالكولاجين من النوع الأول في وجود وسط تمايز.
9. بعد 24 ساعة ، أضف الفئران الطازجة β-NGF (50 نانوغرام / مل) أو حامل PSiO₂ المحمل ب NGF لكل لوحة.
   >ملاحظة: تركيزات NGF الأعلى (>50 نانوغرام / مل) تمتلك التأثير الدقيق كتركيز محدد.
10. تجديد وسيط التمايز كل يومين.
11. لتقييم صلاحية الخلية ، أضف 10٪ (حجم / حجم) من محلول مؤشر الجدوى (القائم على الريزازورين) في نقاط زمنية تمثيلية واحتضانه لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية ؛ قم بقياس الامتصاص عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات AcetoneGadot830101375 AmphotericinBiological Industries03-028-1B Hf المائي (48٪) Merck 101513 AZ4533 مقاوم للضوءشركة ميتال كيمAZ4533 BSA fraction vMP الطب الحيوي216006950 حل BSA (10٪) الصناعات البيولوجية03-010-1B الكولاجين نوع lCorning Inc.354236 كولاجينازإنكوLS004176 أغطية بلاستيكية مطلية بالكولاجينNUNC Thermanox1059846 D- (+) - جلوكوزسيجما ألدريتش كيماوياتG8170 Dispase-IIسيجما ألدريتش كيماويات4942078001 الإيثانول المطلق (99.9٪) ميرك818760 FBSللصناعات البيولوجية04-121-1A Guanidine-HClSigma-Aldrich ChemicalsG7294 Ham's F-12 خليط المغذياتThermo Scientific11765054 HBSSThermo Scientific14185-045 HEPES (1M) Thermo Scientific15630-056 HSللصناعات البيولوجية04-124-1A L-15 متوسطسيجما ألدريتش للكيماوياتL5520 لامينينحراري علمي23017015 L-جلوتامينللصناعات البيولوجية03-020-1A الفئران β-NGFPeprotech450-34-20 حمار عادي مصل (NDS) Sigma-Aldrich ChemicalsG9023 PapainSigma-Aldrich Chemicalsp-4762 PBS (درجة الحموضة 7.4) محضر عن طريق إذابة 10 ملي مولار Na₂HPO₄ ، 1.8 ملي هيلوسنة كلوريد الصوديوم ، 137 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2.7 ملي كلوريد الصوديوم في الماء المقطر المزدوج (ddH₂O ، 18 MΩ·cm).PBS X10للصناعات البيولوجية02-020-1A PC12 خط الخلاياATCCCRL-1721 البنسلين الستربتومايسينللصناعات البيولوجية03-032-1B بولي إل ليسينسيجما ألدريتش للكيماوياتP4832 كاشف بريستو الأزرقالحراري العلميA13261 RPMIمتوسطة الصناعات البيولوجية01-100-1A سي رقاقةSiltronix Corp. مخدر عالي B ، من النوع p ، مقاومة 0.00095 Ω سم ، <100> موجهأزيد الصوديومسيجما ألدريتش كيماوياتS2002 هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) سيجما ألدريتش للكيماوياتS8045 حمض التانيكسيجما ألدريتش للكيماويات403040 تريتون X-100كيمياء إمبكس إنترناشيونال.1279