$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
1. تحضير ثقافة الشريحة
- قم بإعداد مزارع شرائح الحصين العضوية للفأر كما هو موضح سابقا ، باستخدام الفئران بعد الولادة التي تتراوح أعمارها بين 6 إلى 7 أيام من كلا الجنسين.
- تحضير وسائط التشريح لزراعة الشرائح العضوية المكونة من (بالملليمتر): 238 سكروز ، 2.5 كيلو كلوريد ، 1 كلوريد كالسيوم ، 4 ملغ كلوريد ، 26 هيدروكلوريد الصوديوم ₃ ، 1 هيدروهيدرات الصوديوم PO ₄ ، و 11 جلوكوز في الماء منزوع الأيونات ، ثم الغاز بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون / 95٪ O₂ إلى درجة حموضة 7.4.
- تحضير وسائط زراعة شرائح عضوية تتكون من: 78.8٪ (حجم / حجم) الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي ، 20٪ (حجم / حجم) مصل الحصان ، 17.9 ملي مولار NaHCO₃ ، 26.6 ملي جلوكوز ، 2 م كلوريدالهواء 2 ، 2 م MgSO₄ ، 30 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-حمض إيثانسلفونيك (HEPES) ، الأنسولين (1 ميكروغرام / مل) ، و 0.06 ملي مولار حمض الأسكوربيك ، الرقم الهيدروجيني المعدل إلى 7.3. اضبط الأسمولية على 310-330 أوسمول باستخدام مقياس التناضح.
- قم بتشريح الحصين من الدماغ كله باستخدام ملعقتين ، وقم بتقطيعه (400 ميكرومتر) باستخدام مفرمة الأنسجة. افصل الشرائح باستخدام ملقطين وانقلها إلى إدخالات مزرعة خلية مقاس 30 مم في صفيحة 6 آبار مملوءة بوسائط الاستزراع (950 ميكرولتر) أسفل الإدخالات.
- قم بتخزين مزارع الشرائح العضوية في حاضنة زراعة الأنسجة (35 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون) وقم بتغيير وسائط زراعة الشرائح كل يومين.
2. تحضير البلازميد
- تحضير البلازميد للجين محل الاهتمام.
- استنساخ جين البروتين الفلوري الأخضر المحسن (EGFP) في ناقل pCAG.
- قم بتنقية بلازميد pCAG-EGFP باستخدام مجموعة تنقية خالية من السموم الداخلية وقم بإذابتها في محلول داخلي يتكون من مياه معالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات تحتوي على 140 ملي مولار K-methanesulfonate ، و 0.2 ملي مولار من حمض رباعي الأسيتيك من الإيثيلين جلايكول (EGTA) ، و 2 ملي مولار MgCl₂ ، و 10 ملي مولار HEPES ، معدلة إلى درجة الحموضة 7.3 مع KOH (تركيز البلازميد: 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر).
3. تحضير الماصة الزجاجية
- اسحب الماصات الزجاجية البورسليكات (4.5 – 8 ميجا أوم) على مجتذب ماصة دقيقة (الشكل 1 أ).
ملاحظة: تعتبر الماصات الزجاجية المستخدمة في تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة مثالية للتثقيب الكهربائي. - اخبزي الماصات الزجاجية طوال الليل على حرارة 200 درجة مئوية لتعقيمها.
- تحقق من حجم طرف الماصة تحت مجهر التشريح لتقريب المقاومة الكهربائية.
- اختياري: تحقق من مقاومة الماصة عن طريق توصيل الماصة بقطب التثقيب الكهربائي واستخدم المعالج الدقيق لمناورة طرف الماصة في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المعقم بالترشيح (aCSF) الذي يحتوي على (بالمللي مولار): 119 كلوريد الصوديوم ، 2.5 كيلولاريتر ، 0.5 كلوريد الكالسيوم ، 5 ملجمكلوريد الصوديوم ₂ ، 26 هيدروكلوريد الصوديوم ₃ ، 1 هيدروكليوم الصوديوم PO₄ و 11 جلوكوز في ماء منزوع الأيونات ، غاز ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون / 95٪ O₂ إلى درجة حموضة 7.4. تأكد من المقاومة الفعلية باستخدام القراءة الموجودة على المثقب الكهربائي.
ملاحظة: كلما كان طرف الماصة أكثر حدة ، زادت المقاومة الكهربائية. يجب أن تكون مقاومة الماصة أقل من 10 MΩ. غالبا ما تسد الماصات الزجاجية ذات المقاومة العالية للماصة (الشكل 1 ب) عند الطرف أثناء التثقيب الكهربائي المتكرر.
4. إعداد جهاز التثقيب الكهربائي
- قم بتثبيت جهاز الفيزيولوجيا الكهربية القياسي للخلية الكاملة ، ومجهز بمجهر عمودي مركب على طاولة نقل ، ومعالج دقيق ، ومضخة تمعجية.
- قم بتثبيت مرحلة رأس المثقب الكهربائي على مناور دقيق وقم بتوصيل زوج من مكبرات الصوت بجهاز الثقب الكهربائي. قم بتوصيل المثقب الكهربائي بدواسة القدم التي يمكن استخدامها لإرسال نبضة عندما تكون جاهزا.
ملاحظة: تصدر مكبرات الصوت نغمة عند تشغيلها ، وهو مؤشر على المقاومة الكهربائية عند القطب. هذا يجعل من الممكن تحديد التغيرات النسبية في المقاومة دون لفت الانتباه بعيدا عن الإجراء.
5. تحضير التثقيب الكهربائي
- نقل إدراج ثقافة الشرائح من ألواح 6 آبار إلى أطباق بتري 3 سم محملة ب 900 ميكرولتر من وسائط الاستزراع وتخزينها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون على الطاولة حتى تصبح جاهزة لإجراء التثقيب الكهربائي.
- قم باحتضان إدخالات المزرعة الطازجة مسبقا باستخدام وسائط زراعة الشرائح (1 مل) لمدة 30 دقيقة على الأقل في طبق بتري مقاس 3.5 سم لزراعة الشرائح بعد التثقيب الكهربائي.
- قم بتنظيف وإعداد الحفارة للتثقيب الكهربائي.
- قم بتبييض الخطوط باستخدام 10٪ مبيض لمدة 5 دقائق لتعقيم الأنبوب والغرفة قبل بدء التجربة لهذا اليوم.
- قم بنفخ الخطوط بالماء المعقم منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة على الأقل لشطفها تماما.
- قم بدمج الخطوط باستخدام aCSF المعقم بالترشيح الذي يحتوي على 0.001 ملي مولار من السموم الرباعية (TTX).
ملاحظة: يقلل TTX من السمية الخلوية والموت بسبب الإفراط في إثارة الخلايا العصبية الداخلية.
- اضبط معلمات نبض المثقر الكهربائي: سعة 5 فولت ، نبضة مربعة ، قطار 500 مللي ثانية ، تردد 50 هرتز ، وعرض النبضة 500 ميكرو ثانية.
- املأ الماصة الزجاجية ب 5 ميكرولتر من المحلول الداخلي المحتوي على البلازميد.
- قم بإزالة أي فقاعات هواء محاصرة من طرف الماصة عن طريق النقر فوقه والنقر عليه برفق عدة مرات.
- افحص الطرف بحثا عن التلف عن طريق تصوره تحت مجهر التشريح أو بتكرار الخطوة 3.3.1 للتحقق من مقاومة الماصة.
ملاحظة: في حالة تلف الطرف، يجب التخلص من الماصة الزجاجية، ويجب تكرار هذه الخطوة باستخدام ماصة زجاجية جديدة تم إعدادها مسبقا في الخطوة 3.
- قم بتوصيل طرف الماصة بإحكام بالقطب الكهربائي وقم بتشغيل مكبرات الصوت. سجل قراءات (مقاومة الماصة) للمثقب الكهربائي عندما يتلامس الطرف مع وسط aCSF.
- قم بقص غشاء إدخال المزرعة باستخدام شفرة حادة وعزل شريحة واحدة من المزرعة. انقل ثقافة الشريحة بعناية إلى غرفة التثقيب الكهربائي باستخدام ملقط بزاوية حادة وقم بتثبيت موضعها باستخدام مرساة شريحة.
- لا تحتفظ بثقافة الشريحة خارج الحاضنة لأكثر من 30 دقيقة في المرة الواحدة لمنع الآثار الجانبية مثل التغيرات في صحة الخلايا العصبية أو وظيفتها.
6. الخلايا الكهربائية ذات الأهمية
:
- قم بالضغط الإيجابي على الماصة بالفم أو باستخدام حقنة سعة 1 مل (ضغط 0.2 - 0.5 مل) متصلة بالأنبوب.
- استخدم أدوات التحكم في مقبض الماصة ثلاثية الأبعاد للمشغل الدقيق لمناورة طرف الماصة بالقرب من سطح ثقافة الشرائح.
- اختر خلية مستهدفة واقترب منها ، مع الحفاظ على الضغط الإيجابي المطبق حتى تتشكل غمازة على سطح الخلية يمكن رؤيتها تحت المجهر.
- أداء دورات الضغط.
- اضغط بسرعة على شكل ضغط سلبي خفيف عن طريق الفم بحيث يتشكل ختم فضفاض بين طرف الماصة وغشاء البلازما، يشار إليه بصريا بواسطة الغشاء الذي يرتفع إلى طرف الماصة إلى حد ما. لاحظ زيادة (~2.5 ضعف المقاومة الأولية) في مقاومة الماصة من خلال الاستماع إلى زيادة النغمة القادمة من مكبرات الصوت. أعد الضغط الإيجابي بسرعة حتى تتشكل الدمل مرة أخرى.
- أكمل على الفور دورتين أخريين على الأقل من الضغط دون توقف مؤقت ، ثم استمر في الضغط السلبي لمدة 1 ثانية
ملاحظة: يمكن أن يؤدي التوقف المؤقت بين الدورات أو تطبيق الكثير من الضغط أو الضغط السلبي لفترة طويلة إلى تلف كبير للخلية وربما يتسبب في موت الخلية أثناء التثقيب الكهربائي.
- قم بنبض المثقب الكهربائي بسرعة مرة واحدة باستخدام دواسة القدم عندما تصل نغمة السماعات إلى قمة ثابتة في الملعب ، مما يشير إلى ذروة المقاومة الكهربائية. لا تنتظر عند ذروة المقاومة لأكثر من 1 ثانية قبل إرسال النبض.
ملاحظة: لم نلاحظ أي تثقيب كهربائي خارج الهدف عند استخدام هذا البروتوكول. تم نقل الخلايا الملامسة للماصة الزجاجية فقط أثناء دورات الضغط. لا يؤدي وضع الماصة بالقرب من الخلايا العصبية الأخرى إلى تعداء الجينات. - اسحب الماصة برفق على بعد 100 ميكرومتر تقريبا من الخلية دون الضغط عليها.
- أعد تطبيق الضغط الإيجابي ، وتحقق من أن المقاومة مشابهة للقراءة المسجلة في الخطوة 5.5 ، ثم اقترب من الخلية التالية.
>- قم بإزالة السدادات المحتملة، المشار إليها بصريا أو بزيادة كبيرة (>15٪ أعلى) في مقاومة الماصة بعد التثقيب الكهربائي، عن طريق الضغط الإيجابي.
>ملاحظة: إذا لم يكن هناك انسداد مرئي وكانت المقاومة لا تزال أعلى بكثير، فتخلص من الماصة واستخدم ماصة جديدة. في المتوسط، يمكن استخدام الماصة لما يصل إلى 20 حدثا للتثقيب الكهربائي إذا كان المستخدم حريصا.
- بعد التثقيب الكهربائي ، انقل ثقافة الشريحة إلى ملحق مزرعة جديد ، واحتضنه عند 35 درجة مئوية في الحاضنة لمدة تصل إلى 3 أيام.
