A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
يوضح هذا الفيديو التلاعب البصري الوراثي للدوائر العصبية المشاركة في الانتقال من النوم إلى اليقظة في الفئران. يتضمن الإجراء زرع ألياف بصرية وأقطاب كهربائية جراحيا في الدماغ والعضلات لتمكين تحفيز الضوء والتسجيل الفيزيولوجي الكهربي. من خلال توصيل الضوء لتنشيط القنوات الكاتيونية الحساسة للضوء في نواة السرير للسطور الطرفية (BNST) ، يتم تعديل النشاط العصبي ، مما يسمح للباحثين بتحليل إشارات الدماغ والعضلات المرتبطة بتحريض اليقظة.
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. جراحة ، وحقن الفيروسات ، والقطب الكهربائي لمخطط كهربية الدماغ / مخطط كهربية العضل ، وزرع الألياف الضوئية
تنبيه: يجب اختيار تقنيات الحماية والمناولة المناسبة بناء على مستوى السلامة الحيوية للفيروس المراد استخدامه. يجب استخدام الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) في غرفة معزولة متدرجة ب P1A للحقن ، ويجب تعقيم الأنبوب الذي يحمل AAV بالأوتوكلاف بعد نفاد كل الحجم. يجب أن يكون موقع الجراحة وجميع المواد المزروعة نظيفا ومعقمة أثناء الاستخدام.
ملاحظة: انظر الشكل 1.
1. تطهير المعدات الجراحية بالأوتوكلاف.
2. تخدير الفئران بالأيزوفلوران باستخدام مبخر مخدر. راقب حتى يصل الفأر إلى عمق التخدير المطلوب ، والذي يحدده فقدان الاستجابة لقرص الذيل بالملقط. ضع مرهم العيون على العينين لمنعهما من الجفاف.
3. تطهير المجال الجراحي بمحلول اليود أو 70٪ إيثانول (EtOH ، 3x) وجففه بدرجة كافية. اسمح للفيروس بالذوبان على الجليد أثناء إجراء الجراحة. قم بتغطية المنطقة الجراحية بورق مقعد مختبر ماص.
4. ثبت رأس الماوس في الجهاز التجسيمي بقضبان الأذن وقرصة الأنف. بعد التأكد من تثبيت الرأس بثبات ، قم بعمل شق متوسط السهمي في فروة الرأس للتأكد من أن مواضع بريجما ولاجدا تقع على نفس المستوى على خط أفقي.
5. لتجنب فجوة تحديد المواقع ، اضبط مستويات قرصة الأنف وقضبان الأذن لأعلى ولأسفل بشكل مناسب. يشير البريجما واللامدا إلى التقاطع بين sutura saggitalis و sutura coronalis أو sutura lambdoidal ، على التوالي (الشكل 2).
6. استخدم مشابك Serafin لتثبيت الجلد للحفاظ على الوصول إلى الجمجمة. بعد التعرض للجمجمة ، قم بتطهير سطح الجمجمة باليود أو 5٪ H2O2 ، لتمكين خيوط الجمجمة بما في ذلك بريجما ولادا من الرؤية بشكل أكثر وضوحا.
7. تحضير حقن ناقلات AAV:
نمط1. اغسل الجزء الداخلي من حقنة سعة 10 مل (انظر جدول المواد) بالتتابع باستخدام 70٪ EtOH و 100٪ EtOH والماء المعقم ، 5 مرات لكل منهما. قم بتأمين المحقنة في مشبك ذراع مضخة الحقن المجهري وتأكد من تفريغ كل المحلول الموجود في المحقنة.
2. استنشق بعناية 2 ميكرولتر من الزيت المعدني بدون فقاعات هواء، ثم استنشق الحجم المحدد لمحلول الفيروس. بعد الشفط ، قم بمعالجة زر المكبس وتأكد من ظهور محلول الفيروس عند طرف الإبرة.
ملاحظة: تم تحديد حجم حقن محلول الفيروس في تجارب تجريبية باستخدام نفس سلالة الفأر ونفس منتج الفيروس. يجب تقدير العلاقة بين حجم محلول الفيروس ومدى منطقة العدوى مسبقا.
8. حقن متجه AAV:
نمط1. اضبط طرف إبرة الحقن المجهري على بريجما ولاحظ الإحداثيات كنقطة أصلية. انقل الطرف إلى موقع الحقن المخصص (ل BNST: الأمامي الخلفي + 0.2 مم ، ± الوسطي الوحشي 1.0 مم ، الظهري البطني - 4.2 مم) وضع طرف الإبرة في الموضع. ضع علامة على الجمجمة وحفر ثقوبا بقطر 2 مم تقريبا باستخدام مثقاب أسنان بقاطع كربيد 0.7 مم. احرص على عدم إتلاف الجافية أو أنسجة المخ.
2. بعد إزالة الدم من حول الثقوب باستخدام قطعة قطن ، حرك الإبرة ببطء إلى موضع BNST. قم بحقن الكمية المحددة من محلول الفيروس ببطء (0.07 ميكرولتر / دقيقة) باستخدام حاقن ميكانيكي دقيق. بعد الانتهاء من الحقن ، اترك الإبرة لمدة 5 دقائق للسماح للمحلول بالتسلل بشكل كاف إلى أنسجة BNST. قم بإزالة الإبرة بعناية.
3. بالنسبة للحقن الثنائي، كرر الخطوات 1.8.1-1.8.2 على الجانب الآخر. طوال العملية ، ضع محلول ملحي معقم للحفاظ على رطوبة الجمجمة.
ملاحظة: استخدمنا غرسات تخطيط كهربية الدماغ (EEG) / تخطيط كهربية العضل (EMG) المخصصة (العرض: 5 مم ، العمق: 7 مم ، الارتفاع: 1 مم) مع أربعة أقطاب كهربائية لمخطط كهربية الدماغ (4 مم) ، وقطبان كهربائيان لمخطط كهربية الدماغ (2 مم ؛ قطع القطب الكهربائي 4 مم إلى 2 مم باستخدام الكماش) و 6 أقطاب كهربائية (4.5 مم) (الشكل 2 أ).
9. لحام سلكين من الفولاذ المقاوم للصدأ (انظر جدول المواد) يتم تجريد 1 مم من العزل من كلا الطرفين إلى أقطاب EMG. اضبط مركز الأقطاب الكهربائية على البريما ، وحدد موضع كل قطب كهربائي لمخطط كهربية الدماغ (± الأمامي الخلفي 1.5 مم ، ± الوسطي الوحشي 1.0 مم) ، وحدد موضع الغرسة (الشكل 2 ب).
10. زرع الألياف الضوئية:
نمط1. قم بتوصيل حلقة الألياف الضوئية بالمناور وقم بتدوير ذراع المناور بحيث تكون بزاوية ±30 درجة مقابل خط أفقي (هذه العملية مطلوبة فقط لتجنب التداخل بين الأقطاب الكهربائية والألياف البصرية ، كما هو الحال في تحفيز BNST). ضع طرف الألياف على بريجما وسجل الإحداثيات.
2. حرك الطرف إلى خط الإدراج المستهدف وحدد الموضع على الجمجمة. أيضا ، ضع علامات إضافية بالقرب من موقع الإدخال لمسامير التثبيت. حفر الجمجمة في كل موقع باستخدام مثقاب أسنان لإدخال الألياف البصرية وإصلاح المسمار. إصلاح المسمار على الجمجمة. احرص على عدم كسر الجافية أو إتلاف أي أنسجة بالمسمار.
3. أدخل الألياف الضوئية برفق حتى تصل إلى ما فوق BNST باستخدام مناور. يجب أن يستقر الطويق على الجمجمة المتبقية (الشكل 1 ب).
4. ضع الأسمنت القابل للعلاج الضوئي (انظر جدول المواد) لتغطية الألياف والمسمار. يجب تحديد وقت رد الفعل لتصلب الغراء بواسطة دليل الشركة المصنعة (تحتاج موادنا إلى التعرض للضوء لمدة 10 ثوان على الأقل مع مولدات صور ذات طول موجي محدد. ليس من الضروري تجفيف الغراء بعد ذلك).
5. في هذه الخطوة، تأكد من عدم وجود مواد (براغي أو غراء) تشغل مساحة تركيب الأقطاب الكهربائية. بالإضافة إلى ذلك ، تجنب حدوث أي انقطاع في الأسمنت للحلقة المتصلة بالألياف الضوئية والكابل. كرر الخطوات 1.10.1-1.10.4 على الجانب الآخر للتحفيز الثنائي.
11. حفر ثقوب لأقطاب EEG / EMG. أدخل أطراف الأقطاب الكهربائية في الثقوب. أمسك الغرسة وقم بتطبيق مادة لاصقة cyanoacrylate على الفراغ بين الجمجمة والأقطاب الكهربائية. أدخل مرة أخرى مع الانتباه إلى عدم التدخل في أي مواد.
12. قم بتغطية محيط الأقطاب الكهربائية والألياف البصرية بمادة لاصقة cyanoacrylate ، متبوعا بتطبيق مسرع cyanoacrylate على المادة اللاصقة. تتجنب هذه الخطوة التسبب في أي انقطاع في منطقة توصيل الكبل من الطويق إلى البصري وسلك القطب الكهربائي إلى الرصاص (الشكل 1C).
ملاحظة: لاصق سيانواكريليت ومسرعته ضاران بعين الفأر. انتبه حتى لا تتسبب في انسكاب هذه المواد الكيميائية. احرص أيضا على عدم لمس الأقطاب الكهربائية والألياف بقوة لتجنب الانحراف غير المتوقع مباشرة بعد تصلب المادة اللاصقة.
13. كشف عضلات عنق الفأر وأدخل الأسلاك لقطب كهربية العضل تحت العضلات. اضبط طول قطب كهربية العضل بحيث يقع أسفل العضلات القفوية مباشرة. يكفي اتصال خفيف بين طرف القطب الكهربائي واللفافة العضلية لالتقاط إشارة مخطط كهربية العضل.
14. ضع مادة لاصقة cyanoacrylate لملء الغرسات وترسيخ المادة اللاصقة بسائل التسارع. ثم ضع الماوس على وسادة تسخين للتعافي حتى يظهر رد الفعل الوضعي اضبط درجة حرارة وسادة التسخين على درجة حرارة جسم أثناء الراحة (36.0 درجة مئوية في ZT 0-12 في حالة الفئران C57BL6 ؛ لا تتجاوز 38.0 درجة مئوية).
ملاحظة: المضاد الحيوي غير مطلوب للجراحة المعقمة. اتبع الإرشادات المؤسسية المحلية الخاصة بك لتسكين الألم بعد الجراحة. احتفظ بالفئران في قفص منزلي لفترة نقاهة لا تقل عن 7 أيام.
2. مراقبة مخطط كهربية الدماغ / مخطط كهربية العضل مع الإثارة الضوئية للخلايا العصبية المستهدفة في حالات نوم محددة
تنبيه: يتضمن هذا البروتوكول استخدام معدات الليزر من الفئة 3B أو أجهزة LED. يجب أن يكون المجربون على دراية بمعلومات السلامة. مطلوب نظارات واقية للعين.
1. قبل توصيل كابل الليزر بالألياف البصرية ، اضبط شدة الليزر باستخدام قشارة. اربط طرف كابل الليزر بألياف بصرية غير مستخدمة باستخدام حلقة وتأكد من عدم وجود مساحة عند التقاطع بين الألياف والكبل.
2. قم بتشغيل المفتاح الرئيسي لليزر وانتظر 20 دقيقة حتى يسخن.
3. انبعاث الليزر إلى مدقق الكثافة واضبط شدة الليزر على 10 ميجاوات / مم2. قم بتغيير وضع الليزر إلى منطق الترانزستور وتأكد من أن نبضات الضوء تنبعث من الألياف التي يتحكم فيها منظم النمط ، والذي يتم ضبطه على 10 مللي ثانية لمدة ، و 40 مللي ثانية للراحة ، و 20 مرة للدورة ، و 20 مرة تكرار (أي 20 هرتز من نبضات ضوئية 10 مللي ثانية لمدة 20 ثانية).
4. بعد فترة التعافي ، انقل الفئران إلى الغرفة التجريبية لتسجيل مخطط كهربية الدماغ / مخطط كهربية العضل. تم الاحتفاظ بالفئران المنزلية عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 23 درجة مئوية مع دورة إضاءة / مظلمة مدتها 12 ساعة مع توفر الطعام والماء بشكل خاص.
5. قم بتوصيل القطب المزروع ومحول الكابل المرتبط بحلقة الانزلاق لتجنب التشابك. يوصى بتغطية الوصلة بمواد غير منفذة للضوء مثل رقائق الألومنيوم لمنع تسرب الليزر. إذا كانت هناك حاجة إلى تجربة ثنائية ، فاستخدم حلقة انزلاقية مع ملحق متشعب للكابلات.
6. في هذا البروتوكول ، نقوم بتقييم زمن الوصول إلى اليقظة من نوم حركة العين غير السريعة (NREM) أو نوم حركة العين السريعة (REM) ، لذلك يجب أن يكون وقت التسجيل محدودا في وقت zeitgeber الأمثل (يتم تعريف ZT0 على أنه الوقت الذي يكون فيه الضوء مضاء). تم إجراء هذا البروتوكول بين ZT4 - ZT10. دع الفئران تبقى بحرية في الغرفة التجريبية لمدة 1 ساعة على الأقل للتأقلم.
7. خلال الفترة التجريبية ، راقب إشارات مخطط كهربية الدماغ ومخطط كهربية العضل في نفس الشاشة وقم بتقييم حالة الماوس مثل اليقظة أو نوم حركة العين غير السريعة أو نوم حركة العين السريعة. استخدم التحكم في الكسب لكل موجة لتسهيل التمييز بين كل حالة.
8. لقياس نوم حركة العين غير السريعة إلى زمن انتقال اليقظة ، راقب نوم NREM المستقر لمدة 40 ثانية أو نوم حركة العين السريعة المستقر لمدة 30 ثانية ، ثم قم بتشغيل مفتاح مولد النمط للتحفيز الضوئي (يولد هذا البروتوكول 20 هرتز من 10 مللي ثانية نبضات ضوئية لمدة 20 ثانية). تأكيد انبعاث الليزر للألياف البصرية المزروعة.
9. سجل إشارات مخطط كهربية الدماغ / مخطط كهربية العضل حتى تتغير حالة النوم إلى اليقظة. إذا كانت هناك حاجة إلى تجربتين تجريبيتين أو أكثر ، فقم بقصر التلاعب البصري الوراثي على مرة واحدة يوميا لأن التحفيز الضوئي هو تدخل اصطناعي قد يؤثر على بنية النوم / اليقظة.
10. بعد التجربة ، قم بالتخدير العميق والانفتاء باستخدام محلول ملحي معقم وبارافورمالدهيد (PFA) لأخذ عينات من الدماغ بأكمله للتحليل الكيميائي المناعي.
الشكل 1: إجراء حقن AAV وزرع الألياف البصرية وغرسات EEG / EMG. (أ) الإجراء التجريبي لحقن الفيروسات. تم حقن جين ChR2 أو EYFP المدمجة في ناقل AAV الذي يتم تنشيط نسخه بواسطة Cre recombinase بشكل ثنائي في BNST. (ب) تم إدخال الألياف الضوئية باتجاه BNST بزاوية 30 درجة إلى الأفقي لمنع الاصطدام بالقطب. تم إدخال اثنين من المسماري حوله. (ج) تم زرع جهاز تسجيل مخطط كهربية الدماغ / مخطط كهربية العضل بعد وضع الألياف البصرية بشكل آمن. (د) في نهاية العملية ، يجب تغطية المنطقة الجراحية بأكملها بمادة لاصقة سيانواكريليت وتثبيتها بقوة. تأكد من عدم تطبيق أي عامل على المنطقة التي تربط القطب الكهربائي والحلقات
الشكل 2: مواقع إدخال دبابيس قطب كهربائي وقطب كهربائي مخصصة. (أ) أعلى: من بين 6 دبابيس قطب كهربائي ، يتم قطع الدبابيس الخارجية إلى 2 مم. أسفل: أقطاب مخطط كهربية الدماغ / مخطط كهربية العضل. (ب) ثم يتم لحام هذه الأقطاب الكهربائية وأسلاك توصيل مخطط كهربية العضل. يجب عزل منطقة التوصيل بأي عزل ، مثل مادة لاصقة سيانواكريلات. مواقع إدخال الأقطاب الكهربائية مرتبطة بالبريجما (± الأمامي الخلفي 1.5 مم ، ± الوسيط الجانبي 1.0 مم). يتم إدخال أسلاك مخطط كهربية العضل تحت عضلة الرقبة مع إزالة العزل الذي يحمي السلك في موقع الإدخال (1 مم).
