نقل الجينات بوساطة الفيروس إلى نواة القوقعة الظهرية للفأر للتحفيز السمعي الناجم عن الضوء

الملخص

المصدر: Kozin، E.D.، et.al. التصور المباشر لنواة القوقعة الظهرية للفأرة للتحفيز البصري الوراثي للمسار السمعي. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو نقل الجينات بوساطة الفيروسات إلى نواة القوقعة الظهرية للفأر (DCN) لتمكين التحفيز السمعي الناجم عن الضوء. يتم حقن ناقل فيروسي يشفر opsin ، وهو قناة أيونية حساسة للضوء ، في DCN بعد بضع القحف والشفط المخيخي للوصول المباشر. تسمح opsins المعبر عنها بتنشيط الخلايا العصبية بالضوء ، مما يوفر نموذجا لدراسة استجابات المسار السمعي باستخدام علم البصريات الوراثي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الشفط

المخيخي

باستخدام شفط
1. فرنسي 5، استنشق الجزء الجانبي من المخيخ الأيسر الذي يغطي DCN حتى يصبح DCN مرئيا (الشكل 1، اللوحة اليمنى). قم بإزالة ما يقرب من 1/4 إلى 1/3 من المخيخ الأيسر. المعلم الرئيسي المجاور ل DCN هو أمبولة القناة نصف الدائرية العليا.
   ملاحظة: شفط المخيخ هو الخطوة الأساسية في البروتوكول. يتم إجراء الشفط الموجه للمخيخ بنجاح أكبر إذا حدث في محاولة واحدة وليس بتمريرات متعددة من الشفط لأن هذا سيسبب النزيف. للمساعدة في الشفط ، اضبط المستوى البؤري للمجهر على العمق المتوقع للصليب العصبي العصبي ، والذي سيكون بعيدا قليلا عن سطح المخيخ. سيؤدي ضبط المستوى البؤري على CN إلى تحسين التصور وضمان صورة حادة.
2. بعد الشفط ، من المتوقع حدوث مزيد من النزيف وتراكم السائل الدماغي النخاعي وإزاحة المخيخ على DCN. غرس 0.5 سم مكعب من المحلول الملحي المعقم بسرعة في حج القحف لمنع تخثر الدم. يمكن بعد ذلك استخدام مزيج من التربيت اللطيف مع نقطة الأسنان والشفط لإخلاء مسار للتصور المباشر ل DCN. لا تتصل مباشرة بسطح DCN.

2. الحقن المجهري بالضغط لنقل الجينات بوساطة الفيروس والتعافي الجراحي

1. بعد أن يكون DCN خاليا من الدم المغطى والسائل الدماغي النخاعي ويكون مرئيا بوضوح ، قم بإجراء حقن دقيق بالضغط في DCN باستخدام حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر على مدى فترة دقيقتين.
2. أدخل الإبرة باستخدام معالج دقيق حتى يصبح الطرف غير مرئي تحت سطح DCN.
3. للحصول على الأداء الأمثل ، استخدم إبرة قياس 33 أو 34 (استخدم حقنة محكمة الغلق بإبرة قياس 34) بشطبة ضحلة ، مثل 45 درجة ، لتقليل الصدمة الحادة وتوطين حجم الحقن داخل DCN ، وهو عبارة عن بنية جذع دماغ رقيقة وضحل (بسمك <300 ميكرومتر).
   ملاحظة: يمكن استخدام أدوات الحقن المجهري الأخرى. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون أداة الحقن مرنة بما يكفي للسماح ببعض الانحناء الطفيف إذا لزم الأمر لاستهداف DCN مباشرة. علاوة على ذلك ، عندما يتحرك الماوس قليلا طوال الإجراء بسبب التنفس ، يجب أن تكون الأداة قوية بما يكفي لتحمل كميات طفيفة من الحركة.

3. التعافي الجراحي

1. مباشرة بعد الحقن ، أعد تقريب الجلد واسمح للفأر بالتعافي وفقا لإجراء الاسترداد القياسي. سوف يملأ المخيخ والأنسجة الندبية المتبقية التجويف الناجم عن شفط المخيخ. راقب باستمرار حتى يتم استعادة الوعي الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. مراقبة معدل ضربات القلب ومعدل التنفس وكذلك القدرة على التغذية.
   ملاحظة: لا يتم إرجاع أي خضع لعملية جراحية إلى قفص مع أخرى حتى يتعافى تماما.
2. إذا بدأ الفأر في المشي في دوائر بعد الجراحة (<5٪ من الحالات) ، عادة بعد 2-4 ساعات من إغلاق شق الجلد ، فقم بالتضحية بالفأر على الفور ، حيث من المحتمل أن يواجه صعوبة في التغذية. من المحتمل أن يكون هذا التأثير الجانبي بسبب طموح المخيخ. يجب مراقبة بحثا عن الألم بعد الجراحة ، ويجب إعطاء المخدرات المناسبة لضمان راحة بناء على المعايير المؤسسية. قد تكون المضادات الحيوية ضرورية, إذا كان هناك دليل على العدوى.

النتائج

فئة الشكل = 'image image-style-align-center image_resized' style='display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75٪;'>

الشكل 1: يوضح الشفط المخيخي الجزئي الوصول إلى نواة القوقعة الظهرية. اللوحة اليسرى: بعد وضع الفأر في الحامل ، يتم إجراء شق عمودي عبر الجلد والأنسجة الرخوة على طول الجانب الخلفي من الجمجمة إلى الأنسجة الرخوة للرقبة. يتم وضع الجلد بشكل جانبي ، وتتم ...

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حامل StereotaxicStoelting51500 5 التماثل الجراحيالفرنسي 2777914 نقاط الأسنانهنري شاين100-8170 Bone rongeur < td colspan = '1' rowspan = '2'>Fine Surgical Tools < td colspan = '1' rowspan = '2'>16020-14 10 μl Hamilton syringeHamilton7633-01 34 gauge ، needleهاميلتون < td colspan = '1' rowspan = '2'>207434 RongeursFine SurgicalTools 16021-14