مقالة منهجية

التجديد المحوري في العصب الوركي للفأر بعد إصابة السحق

أغسطس 29, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Li, Q., et al. التحقيق في تجديد المحور العصبي للثدييات: في الجسم الحي التثقيب الكهربائي للعقدة الجذرية الظهرية للفأر البالغ. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو عملية التجديد المحوري في العصب الوركي للفأر بعد إصابة السحق. يتم إصلاح العصب المعزول وإعداده للتصوير ، مع التعبير عن البروتينات الفلورية في الخلايا العصبية لتصور نمو المحور العصبي. باستخدام مجهر epifluorescence ، يتم تتبع تجديد المحور العصبي من موقع الإصابة لتقييم مدى إعادة النمو.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. المواد والكواشف

    1. استخدم إناث الفئران CF1 البالغة من العمر ستة أسابيع والتي تزن 30-35 جراما للتجارب.
      ملاحظة: تم إيواء الفئران في مجموعات (5 فئران لكل قفص) في أقفاص معقمة ذات تهوية فردية مع فراش كوز ذرة 1/4 بوصة و 2 "أعشاش مربعة للتعشيش. تم الحفاظ على الأقفاص في دورة ضوء وظلام خاضعة للرقابة لمدة 12 ساعة وكانت درجة حرارة الغرفة بين 19.4 درجة مئوية و 25 درجة مئوية. تم تغذية الفئران بنظام غذائي عالمي للقوارض ونظام إمداد تلقائي بالمياه.
  2. الأدوات
    1. استخدم الأدوات الجراحية التالية لإجراء الجراحة بكفاءة: المحاقن التي تستخدم لمرة واحدة (27 جم ، 1.0 مل) للحقن داخل الصفاق ، ومقص الفراء ، ومجهر تشريح ستيريو ، وملقط الجراحة المجهرية ، ومقص الجراحة المجهرية ، والعظام الصغيرة والإسفنج غير المنسوج المعقم.
      ملاحظة: يتم تعقيم جميع الأدوات والمواد قبل الجراحة أو تعقيمها مسبقا من قبل المنتجين. أثناء الجراحة ، يتم رش الأدوات بالكحول بنسبة 75٪ للحفاظ على العقم.
  3. حلول التخدير
    1. استخدم محلول التخدير #1 للحث على التخدير واستخدام محلول التخدير #2 قبل حقن العقد الجذرية الظهرية (DRG) للحفاظ على التخدير.
      1. لعمل محلول مخدر # 1 ، قم بتخفيف الكيتامين والزيلازين في محلول ملحي معقم بتركيز نهائي يبلغ 10 مجم / مل و 1.2 مجم / مل.
      2. لعمل محلول مخدر # 2 ، قم بتخفيف الأفيرتين في محلول ملحي معقم بتركيز نهائي قدره 20 مجم / مل.
  4. بلازميد الحمض النووي والحمض النووي الريبي Oligos
    1. قم بإعداد البلازميدات باستخدام المجموعة التجارية باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة وفقا لذلك. قم بتخفيف الحمض النووي البلازميد في الماء المعقم منزوع الأيونات بتركيز 2.0 ميكروغرام / ميكرولتر.
    2. أضف محلول صبغة Fast Green للوصول إلى التركيز النهائي من 0.005-0.01٪ (حجم / حجم) للحصول على تصور أفضل لمخطط DRG أثناء الحقن.
    3. قم بإذابة الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) أو قليل النوكليوتيدات microRNA (microRNA oligos) في المخازن المؤقتة المقابلة التي يوفرها المصنعون للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ميكرومتر.
  5. ماصة الحقن الدقيق
    1. اسحب الزجاج الشعري باستخدام مجتذب الماصة الدقيقة وقم بقص طرف الماصة الزجاجية الشعرية المسحوبة بمقص الجراحة المجهرية لإنشاء فتحة بقطر خارجي تقريبي 50 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بتعقيم الماصة الزجاجية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية على مقعد نظيف لمدة 20-30 دقيقة تقريبا.
    2. قم بتركيب الماصة الزجاجية المعقمة على حامل الماصة المتصل بنظام توزيع الحقن المجهري داخل الخلايا. اضبط معلمات نظام الحقن المجهري عند 30 رطل لكل بوصة مربعة من الضغط و 8 مللي ثانية من المدة.
  6. نظام التثقيب الكهربائي
    1. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بنظام التثقيب الكهربائي للموجة المربعة وقم بتعيين المعلمات التالية: نبضات 15 مللي ثانية عند 35 فولت مع فواصل 950 مللي ثانية للتثقيب الكهربائي في الجسم الحي.
  7. محلول التروية والتثبيت
    1. قم بإذابة مسحوق بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) بتركيز 4٪ (وزن / حجم). قم بتخزين محلول PFA عند 4 درجات مئوية.

2. الإجراءات

  1. التجريبية التعرض الجراحي ل L4 و L5 DRGs
    1. تخدير الفأر باستخدام حقن داخل الصفاق لمحلول التخدير # 1 المحضر مسبقا (مع الكيتامين 100 مجم / كجم من وزن الجسم والزيلازين 12 مجم / كجم من وزن الجسم).
    2. احلق المنطقة الجراحية باستخدام مقص الفراء.
      ملاحظة: نظرا لإجراء عملية جراحية أخرى لسحق العصب الوركي الأيسر ، يمكن حلق فرو الفخذ الخلفي الأيسر في وقت واحد.
    3. ضع الماوس على البطانية الساخنة (35.0 درجة مئوية) وراقب درجة حرارة المستقيم باستخدام مسبار درجة الحرارة.
    4. لاختبار التخدير ، اضغط على أصابع وذيل الفأر ولاحظ الاستجابات السلوكية.
    5. قم بلصق الأطراف الأربعة للفأر على لوح الفلين.
    6. امسح المنطقة الجراحية بمحلول اليودوفور ثم استخدم 75٪ كحول لإزالة اليودوفور قبل قطع الجلد.
    7. ضع مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
    8. قبل الشق ، ضع علامة على جانبي القمم الحرقفية بقلم تحديد ناعم. ارسم خطا يربط بين نقطتي القمم الحرقفية لتسهيل تحديد مواضع L5 DRGs.
    9. قم بعمل شق 3 سم على طول خط الوسط لأسفل الظهر باستخدام مقص دقيق. علاوة على ذلك ، افصل العضلات الطفيلية ، مثل العضلي المتعدد والعضلة الطويلة القطنية ، من العمليات الشائكة L3 إلى S1 ، وفضح مفاصل الوجه من L4-5 و L5-6.
    10. استخدم ميكرو رونجور لإزالة مفاصل الوجه L4-5 و L5-6. علاوة على ذلك ، قم بإزالة القوس العصبي الأيسر ل L4 و L5 لفضح الجانب الظهري من DRGs.
  2. حقن DRG
    1. حقن محلول مخدر #2 (مع أفيرتين 200 ملغ/كغ من وزن الجسم) داخل الصفاق للحفاظ على التخدير قبل حقن DRG.
    2. قم بتحميل بلازميدات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي oligos (1 ميكرولتر لكل DRG) في الماصة الزجاجية الشعرية.
    3. أدخل طرف الماصة الزجاجية الشعرية بعناية في DRG.
      4. قم
    4. بحقن محلول 1.0 ميكرولتر تدريجيا من بلازميدات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي oligos في DRG باستخدام أنظمة توزيع الحقن المجهري داخل الخلايا (30 رطل لكل بوصة مربعة ، 8 مللي ثانية).
      ملاحظة: يجب ألا تقل مدة الحقن عن 5 دقائق.
  3. التثقيب الكهربائي<ol style='list-style-type:decimal;'>
  4. قم بإسقاط PBS على أطراف الأقطاب الكهربائية.
  5. نظف النزيف بشاش قطني مربع معقم.
  6. اضغط على DRG المستهدف باستخدام الأقطاب الكهربائية برفق وقم بتطبيق 5 نبضات كهربائية مربعة باستخدام نظام التثقيب الكهربائي.
  7. أغلق طبقات العضلات والجلد على التوالي باستخدام 5-0 خيوط نايلون.
  8. ضع الفأر على بطانية ساخنة (35.0 درجة مئوية) تحت عناية فائقة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. أعد الماوس إلى القفص المنزلي بعد أن يتعافى تماما من التخدير.
    ملاحظة: يستغرق الماوس حوالي 60 دقيقة ليتعافى تماما من التخدير على بطانية 37 درجة مئوية. قم بإذابة حبة واحدة (200 مجم) من الإيبوبروفين في 1,000 مل من الماء (0.2 ملغ/مل) للتغذية اليومية لتخفيف آلام ما بعد الجراحة.
  • سحق العصب الوركي
    1. يومين أو ثلاثة أيام (حسب التصميم التجريبي) بعد التثقيب الكهربائي DRG, تخدير الفأر داخل الصفاق مع محلول مخدر #2 (مع أفيرتين 400 ملغ/كغ من وزن الجسم).
    2. قم بلصق الأطراف الأربعة للفأر على لوح الفلين.
    3. قم بعمل شق 1 سم 0.5 سم إلى الجانب الأيسر على طول خط الوسط. قطع العضلات, مثل الألوية الكبيرة العضلة والعضلة الكمثري, طوليا. كشف جزء من العصب الوركي بين الثقبة الوركي الأكبر والشق الوركي.
    4. سحق العصب باستخدام ملقط الجراحة المجهرية لمدة 12 ثانية وقم بتمييز موقع السحق بخيط نايلون 10-0. اصنع عقدة على الغشاء الجافوي لتحديد موقع السحق.
    5. أغلق طبقات العضلات والجلد بخياطة 5-0 من النايلون.
    6. ضع الفأر على بطانية ساخنة (35.0 درجة مئوية) بعناية فائقة حتى يستعيد وعيه الكافي تماما للحفاظ على الاستلقاء القصي. أعد الماوس إلى القفص المنزلي بعد أن يتعافى تماما من التخدير.
      ملاحظة: يستغرق الماوس حوالي 60 دقيقة ليتعافى تماما من التخدير على بطانية 37 درجة مئوية. قم بإذابة حبة واحدة (200 مجم) من الإيبوبروفين في 1,000 مل من الماء (0.2 ملغ/مل) للتغذية اليومية لتخفيف آلام ما بعد الجراحة.
  • نضح الفأر ، DRG ، وحصاد العصب الوركي
    1. بعد يومين أو ثلاثة أيام من سحق العصب الوركي (اعتمادا على التصميم التجريبي) ، قم بتخدير الفأر داخل الصفاق بمحلول مخدر # 2.
    2. قم بتنقية الماوس عبر القلب باستخدام PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) متبوعا بمثلج بارد 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) (الرقم الهيدروجيني 7.5) في PBS.
    3. بعد التروية ، افصل DRGs مع جذور الأعصاب والعصب الوركي قبل الركبة بعناية باستخدام مقص دقيق وملقط دقيق تحت مجهر التشريح. ضع العصب الوركي مباشرة في 4٪ PFA طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  • تصوير وقياس المحاور الحسية المسماة بالفلورة
    1. انزع الأنسجة والغشاء المرفقين على العصب الوركي الثابت باستخدام مقص دقيق وملقط دقيق بعناية تحت مجهر التشريح. ثم استبدل 4٪ PFA مع PBS واغسل العصب ثلاث مرات.
    2. ضع العصب الوركي على شريحة واحتفظ به مستقيما. أضف 80 ميكرولتر من المحلول المضاد للبهتان حول العصب ، ثم ضع غطاء عليه. تسطيح الأنسجة المثبتة بالكامل بالضغط.
    3. ضع الأنسجة المسطحة على مجهر epifluorescent المقلوب المجهز بملحق للحصول على الفسيفساء ومعالجة الصور.
      ملاحظة: أطوال الإثارة والانبعاث هي 488 نانومتر و 509 نانومتر. من الممكن أيضا التقاط صور متداخلة متعددة يدويا وتجميع الصور معا باستخدام ImageJ مع المكون الإضافي Mosaic.
    4. عند قياس طول المحاور المتجددة ، تتبع جميع المحاور المحورية ذات العلامات الفلورية التي يمكن تحديدها في العصب الوركي من موقع السحق (المميز بخيطة العصبية 10-0) إلى نهايات المحور العصبي البعيد.

    • الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    < فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ECM 830 نظام التثقيب الكهربائي للموجة المربعةBTX Harvard Apparatus45-0052ل في الجسم الحي الكهربائيةTweezertrodes أقطابBTX Harvard Apparatus45-0524ل in vivo electroporation ، 1 مم مسطحةPicospritzer IIIParker Instrumentation1096أنظمة الاستغناء عن الحقن المجهري داخل الخلايامجتذب الشعيرات الدموية الزجاجيةNARISHIGEPC-10 الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكاتWorld Precision Instruments، Inc.1902328 مجهر تشريح ستيريوLeicaM80 الجراحة المجهرية RongeurFST16221-14 ملقط الجراحة المجهريةFST بواسطة DUMONT ، سويسرا11255-20فقط لسحق العصب الوركيGlass CapillaryWorld Precision Instruments، Inc.TW100-410 سم ، شريط حائط قياسيFisherbrand15-901-30لتثبيت الماوس على لوح الفلين2 ، 2 ، 2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-AldrichT48402محلول مخزون Avertin2-methyl-2-butanolSigma-Aldrich152463 محلول مخزون AvertinsiRNA التحكم السلبي العالمي الفلورسنت # 1Sigma-AldrichSIC003siRNA غير المستهدف معmicroRNA الفلوري تقليد التحكم في التعدي مع Dy547DharmaconCP-004500-01-05microRNA غير المستهدف معطقم تحضير البلازميدات المضان Invitrogen PurelinkK210016تحضير بلازميد ترميز GFPصبغة خضراء سريعةMillipore-SigmaF7252لتصور أفضل لمخطط DRG أثناء الحقنKetaminePutney، IncNDC 26637-731-51تحريض التخديرXylazineAnaSedNDC 59399-110-20تحريض التخديرأسيتامينوفينMcNeil Consumer HealthcareNDC 50580-449-36تخفيف الآلام بعد الجراحة

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    مقالات ذات صلة