الزرع التجسيمي لتعليق الخلايا العصبية في فأر مصاب بإصابات الدماغ الرضحية

الملخص

المصدر: Furmanski، O.، et al. نموذج التأثير القشري المتحكم فيه لإصابة دماغ الفئران مع الزرع العلاجي للخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، يتم حقن الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان بشكل مجسم في حدود المادة الرمادية والبيضاء للقشرة العميقة في نموذج فأر لإصابة الدماغ الرضحية. تندمج الخلايا المزروعة في الأنسجة ، مما يعزز التعافي الوظيفي وإصلاح الدوائر في الدماغ المصاب.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الزرع التجسيمي لتعليق الخلايا

1. ابدأ إجراء زرع الخلايا بعد 24 ساعة تقريبا من استئصال التلوين.
2. قم بإعداد معدات زرع الخلايا والمستلزمات الجراحية
   1. املأ حقنة ذات طرف انزلاقي سعة 1 مل بمحلول ملحي معقم لري الجروح. قم بتوصيل إبرة 25 جم بالمحقنة للتحكم في الري.
   2. املأ حقنة ذات طرف انزلاقي سعة 1 مل بمحلول CsA (Cyclosporine A) لتثبيط المناعة. قم بتوصيل إبرة 25 جم أو أكبر بحقنة CsA. أعد تعبئة حقنة CsA حسب الحاجة بين العمليات الجراحية.
   3. قم بإعداد الإبر الزجاجية من ماصات شعرية زجاجية من البورسليكات مقاس 1.0 مم OD (القطر الخارجي) باستخدام الطرق القياسية.
   4. استخدم ملاقط دقيقة لكسر أطراف الإبرة إلى قطر 200 ميكرومتر تقريبا. تأكد من أن العمود الأسطواني للإبرة لا يزيد عن 2.5 سم.
3. معايرة مضخة الحقنة للاستخدام مع حقنة سعة 10 ميكرولتر. أدخل معدل تدفق قدره 0.2 ميكرولتر / دقيقة لتقديم حجم إجمالي قدره 2.0 ميكرولتر.
4. تحضير معلق الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحث عن طريق الإنسان (hiPSC).
   1. قم بإجراء جميع عمليات التعامل مع الخلايا في غطاء لثقافة الخلايا BSL-2 (السلامة الحيوية المستوى -2) باستخدام تقنيات المناولة المعقمة القياسية.
   2. قم بإعداد مزارع الخلايا مسبقا وفقا للشروط القياسية المحددة لنوع الخلية.
      ملاحظة: استخدمت التجارب الموضحة في هذا العرض التوضيحي العديد من خلايا النمط الظاهري العصبية المشتقة من hiPSCs.
   قم
   3. بفصل الخلايا برفق إلى معلق أحادي الخلية باستخدام محلول انفصال الخلية ، أو غيرها من الوسائل الأنزيمية أو الكيميائية المفضلة.
   4. عد الخلايا في حالة تعليق ، ثم قم بتخفيف المعلق إلى 5 × 10⁴ خلايا / ميكرولتر في الحد الأدنى من وسط زراعة الخلايا (على سبيل المثال ، DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)) في أنبوب اختبار علوي قابل للطي سعة 1.7 مل.
   5. لاحظ الملاحظات التالية للزرع:
      1. حافظ على الخلايا معلقة عند 37 درجة مئوية طوال مدة الإجراءات.
      2. قم بتحميل المحقنة مباشرة قبل إجراء الحقن داخل المتني
         ملاحظة: إذا تم وضع تعليق الخلية على جانبه ، فقد تتسبب الجاذبية في استقراره أو التشبث بجانب المحقنة ، مما يؤدي إلى مخالفات في عدد الخلايا المحقونة.
      3. تخصيص ~ 5 × 10⁵ خلايا (تعليق 10 ميكرولتر) لكل فأر في حالة إجراء عمليات زرع خلايا متعددة في يوم واحد.
5. إجراء جراحة الزرع التجسيمي
   1. ضع الفأر في غرفة تحريض التخدير متصلة بمبخر الأيزوفلوران بمصدر أكسجين مضغوط. تحفيز التخدير مع ~ 3٪ الأيزوفلوران عند ~ 0.7 لتر / دقيقة من الأكسجين.
   2. ضع الماوس في إطار تجسيمي مع مخروط أنف مخدر متصل.
      1. ثبت الرأس في مكانه باستخدام قضبان أذن وقضيب لدغة ، وتوجيه الرأس بحيث يكون عظم الجمجمة الأمامي أفقيا. حافظ على التخدير عند 1.5٪ - 2٪ إيزوفلوران طوال مدة الجراحة.
   3. قم بإجراء الرعاية قبل الجراحة والتحضير المعقم
      1. ضع مرهم مرطب للعيون يحتوي على مضادات حيوية على العينين باستخدام قطعة قطن.
      2. اغسل موقع الشق بمحلول ملحي معقم لتنظيف الموقع وفك الغرز. ضع برفق 70٪ من الإيثانول بقطعة قطن لتعقيم موقع الشق.
   4. قم بإزالة الغرز باستخدام ملاقط دقيقة ومقص عيني. ري موقع الجراحة واستئصال التقرن الكهربائي بمحلول ملحي معقم وفير.
      1. إذا أظهرت القشرة خصائص غير مؤهلة، مثل الفتق المفرط أو تغير اللون أو تعطل الأوعية الدموية أو النزيف، فيجب استبعاد.
   5. قم بتحميل حقنة زرع الخلية
      1. انقل تعليق الخلية من حاضنة 37 درجة مئوية إلى غطاء السلامة الحيوية لزراعة الخلايا. قم بتدوير الأنبوب برفق أو النقر عليه لضمان تعليق خلوي متجانس.
      2. استخدم ماصة صغيرة لتحميل ~7.5 ميكرولتر من معلق الخلية في حقنة هاميلتون من خلال طرف المكبس.
         1. أمسك المحقنة بزاوية ~ 120 درجة بحيث يكون طرف المكبس متجها لأسفل. أدخل المكبس ، مع الحرص على عدم إدخال فقاعة هواء بين التعليق وطرف المكبس.
      3. قم بتوصيل مجموعة الحشية بإبرة الماصة ، ثم قم بتوصيل الإبرة بالمحقنة.
      4. ادفع المكبس لتحريك تعليق الخلية إلى إبرة الماصة. إذا كانت هناك مقاومة ضد تدفق التعليق ، فاستخدم ملاقط دقيقة لكسر طرف الإبرة لتكبير القطر.
   6. قم بتوصيل المحقنة بمضخة الحقنة التجسيمية. تقدم المكبس للتأكد من أن مجموعة مضخة الحقنة تعمل بشكل صحيح.
   7. حرك الإبرة إلى إحداثيات الحقن.
      1. قم بمحاذاة طرف الإبرة مع bregma. اضبط إحداثيات X و Y على 0. ثم حرك طرف الإبرة فوق استئصال التقرن إلى 2.0 مم جانبيا و -1.0 مم خلف البرغيما. المس طرف الإبرة على سطح الأم الجافية واضبط الإحداثيات التجسيمية على Z = 0.
      2. ادفع المكبس للتأكد من أن تعليق الخلية يتدفق بشكل كاف قبل إدخال الإبرة في الدماغ.
      3. أدخل الإبرة في الدماغ على عمق Z = -1.4 مم. تضع هذه الإحداثيات التجسيمية الكسب غير المشروع عند حدود المادة الرمادية والبيضاء للقشرة العميقة.
   8. ابدأ تشغيل مضخة الحقنة لبث تعليق الخلية. اضبط مؤقت مقعد المختبر على 15 دقيقة وابدأ المؤقت. استخدم مجهر طويل المدى لمراقبة تدفق تعليق الخلية.
      1. قم بري موقع الجراحة بمحلول ملحي معقم أثناء الحقن للحفاظ على ترطيب الأنسجة.
      2. في 15 دقيقة ، اسحب إبرة الزرع ببطء. ري موقع الجراحة بالمحلول الملحي وإغلاق الشق بالخيوط.
   9. أداء رعاية ما بعد الجراحة
      1. توقف عن التخدير. توصيل CsA عن طريق الحقن تحت الجلد في القفص بجرعة 10 ملغ/كغ. ضع الفأر في قفص نظيف ودافئ مسبقا بعد الجراحة.
      2. توفير مسكن الأسيتامينوفين في مياه الشرب بمعدل 1.0 مجم / مل.
         ملاحظة: توفير التسكين وفقا لبروتوكول التشغيل القياسي (SOP) التابع للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) ومراعاة متغيرات النتائج التجريبية.
      3. توفير قفص مبلل لاستعادة طعام الطعام للمساعدة في الجفاف والتعافي.
6. استمر في حقن CsA اليومية بمعدل 10 مجم / كجم طوال مدة بقاء الفأر.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1 مل محاقنBecton Dickinson (BD)309659 1.7 مل أنابيب اختبار قابلة للطي DenvilleC2170 حقنة 10 ميكرولترهاميلتون7635-01 25G إبر حقنة Precision GlideBecton Dickinson (BD) 305122 70٪ إيثانول المنتج المفضل ؛ يختلف حسب المنطقةمعلق الأسيتامينوفين عن طريق الفمتايلينول (للأطفال) مخفف إلى 1 مجم / مل في الماءمبخر مخدرVetland0521-11-22 قماش مناولةالشراء من متجرBetadinePurdue ProductsNDC-67618-151-32 الأكسجين المضغوط المنتج المفضل ؛ يختلف حسب المنطقةالسيكلوسبورين ASigma-Aldrich30024-100mg ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) Sigma-AldrichD8418-500ml DMEMInvitrogen (ThermoFisher) A14430-01 شريط كهربائي3M Corporation الشراء من متجر متعدد الأقسامملاقط دقيقةأدوات العلوم الدقيقة11254-20 ملقطأدوات العلوم الدقيقة91106-12 ماصات شعرية زجاجية ، 1 مم OD ، 0.58 مم IDWorld Precision Instruments1B100F-3طقم المحركات الدقيقة الدوارة عالية السرعةشركة Foredom Electric Co.K.1070 - K.107018 مجموعة شفرات مثقاب صغيرة مثالية مكونة من 5نقاط خلية علمية60-1000 تأثير واحد مصطدم تجسيمي ل CCILeica Biosystems39463920 IsofluraneBaxterNDC-10019-360-60 مؤقتات مقاعد البدلاء المختبريةفيشر ساينتفيك14-649-17 ماصة دقيقة مجتذبMicroData Instruments، Inc.PMP-102أي مجتذب سوف يكفيزلات غطاء المجهرFisherbrand12-545-E المجهر شريحة تركيب متوسط المنتج المفضلمرآة الشراء من متجر متعدد الأقسامحامل إبرة إرقاءأدوات العلوم الدقيقة12002-12 طب العيون مرهمفالكون للمستحضرات الصيدلانيةNDC-61314-631-36 مقص زنبركي للعيونأدوات العلوم الدقيقة15018-10 صندوق بلاستيكي الشراء من متجر متعدد الأقساماسطوانة بلاستيكية الشراء من متجر متعدد الأقساممضخة حقنة آلية QSIStoelting53311 تركيب ضغط إبرة قابلة للإزالةهاميلتون55750-01 إطار تجسيمي صغير للقوارضStoelting51925 مقص صغيرأدوات العلومالدقيقة 14060-09 StemPro AccutaseInvitrogen (ThermoFisher) A1110501 وسادات تحضير الكحول المعقمةFisherbrand06-669-62 مسحات قطنية معقمة / Kendall Q-tipsTyco Healthcare540500 محلول ملحي معقمHospiraNDC-0409-1966-07 ساعات توقيت (2)فيشر ساينتفيك06-662-56 شرائح مجهر Superfrost Plus GoldFisherbrand15-188-48 خيوط خيوط - 5.0 حرير بإبرة منحنيةواحةMV-682