نقل الفيروسات العدسية للخلايا السلفية العصبية للتنظيم اللاجيني لتعبير ألفا سينوكلين

الملخص

المصدر: Tagliafierro, L., et al. منصة ناقلات الفيروسات العدسية للتسليم الفعال لأدوات تحرير الجينوم في نماذج الأمراض المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو نقل الفيروسات العدسية للخلايا السلفية العصبية (NPCs) للتعديل اللاجيني المستهدف لألفا سينوكلين ، وهو بروتين رئيسي في مرض باركنسون. يتيح البروتوكول مثيلة الحمض النووي بوساطة ميثيل ترانسفيراز ، مما يقلل من تعبير SNCA لدراسة تنظيم الجينات والتدخلات العلاجية المحتملة.

البروتوكول

1. تمايز الخلايا السلفية العصبية الدوبامين

1. ذوبان MD NPCs (الخلايا السلفية العصبية الدوبامين في الدماغ المتوسط)
   1. انقل الخلايا من cryovial إلى الأنبوب الذي يحتوي على DMEM / F12. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
   2. استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من N2B27 ، وأضف تعليق الخلية إلى بئر واحد من اللوحة المطلية ب BMM. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

2. تحويل MD NPCs وتحليل تغيرات المثيلة

1. تحويل MD NPCs
   1. transduce MD NPCs عند التقاء 70٪ مع LV (ناقل الفيروسات العدسية) دليل RNA / Cas9-DNMT3A غير المنشط (إنزيم ميثيل ترانسفيراز DNA 3A) في MOI (تعدد العدوى) = 2. استبدل N2B27 المتوسط 16 ساعة بعد التنبيغ.
   2. أضف N2B27 مع 5 ميكروغرام / مل من البيرومايسين ، بعد 48 ساعة من التنبيغ. استزراع الخلايا لمدة 3 أسابيع في N2B27 بالإضافة إلى بورومايسين للحصول على خطوط MD NPC المستقرة. الخلايا جاهزة للتطبيقات النهائية (الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، وتحليلات البروتين ، وتوصيف النمط الظاهري ، والتجميد ، والمرور).

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Equipment 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية Corning430791 6 آبارCorning3516 Allegra 25R أجهزة الطرد المركزي المنضديةبيكمان كولتر369434 مجهر مضان مقلوبLeicaDM IRB2 كواشف زراعة الخلايا محلول مضاد للمضادات الحيوية ومضاد للفطريات ، مكمل 100XSigma AldrichA5955-100ML B-27 (50X) ، ناقص فيتامين أThermo Fisher Scientific12587010 كورنينج ماتريجل hESC مؤهل مصفوفةكورنينج08-774-552 DMEM-F12Lonza12-719 N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific17502001 Neurobasal medium thermo Fisher Scientific21103049