في الرحم نقل الفيروس في الفأر

الملخص

المصدر: Lutz، D.، et al. تقييم معلمات المرونة العصبية فوق البنية بعد نقل الرحم لدماغ الفأر النامي والحبل الشوكي. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو النقل الفيروسي عن طريق الحقن داخل الرحم في أجنة الفئران. يتم تحضير فأر حامل للجراحة ، ويتم إجراء شق خط الوسط لكشف قرون الرحم. يتم حقن خليط من الفيروس يحتوي على الجين المطلوب وصبغة تتبع في الأجنة داخل أكياس الرحم في المواقع المستهدفة. ثم يتم وضع قرون الرحم مرة أخرى قبل الخياطة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. في تنبيغ

الرحم

1. قم بإعداد ترميز الفيروس المرتبط بالغدة من النوع 1 (AAV1) للهدف المطلوب (4 × 10¹¹ جسيما فيروسيا / ميكرولتر من AAV1) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند درجة الحموضة 7.4. أضف 0.1 مجم / ميكرولتر Fast Green واحتفظ بخليط AAV1-Fast-Green عند 37 درجة مئوية.
2. قم بإعداد طرف شعري رفيع بالشكل المطلوب (طوله 8 مم ، بقطر خارجي 80 ميكرومتر وقطر داخلي 50 ميكرومتر) باستخدام مجتذب ماصة دقيقة (الإعدادات: الضغط = 500 ، الحرارة = 700 ، السحب = 0 ، السرعة = 80 ، الوقت = 200 ، انظر جدول المواد). كسر طرف الشعيرات الدموية بحيث يكون 4-5 مم.
3. قم بتجميع أنبوب شفاط (44 سم × 0.7 سم) بالطرف الشعري وشفط 15 ميكرولتر من خليط AAV1-Fast-Green في الشعيرات الدموية.
4. حافظ على الأشخاص الحيوانيين في درجة حرارة فسيولوجية ثابتة للجسم تبلغ 37 درجة مئوية طوال الإجراء.
5. ضع فأرة C57Bl / 6 حامل (اليوم الجنيني 14.5) في غرفة ما قبل الحضانة وقم بتخدير الفأر بإيزوفلوران غازي 4٪ (بمعدل تدفق هواء حجمي 0.6-0.8 لتر / دقيقة).
6. تحت الجلد ، حقن البوبرينورفين (0.1 مجم / كجم من وزن الجسم).
7. ضع الفأر المخدر على الصفيحة الجراحية الدافئة مسبقا (37 درجة مئوية).
8. غطي العينين بمواد تشحيم.
9. قم بتركيب الفأر مع قناع التخدير (غازي 1.5٪ إيزوفلوران بمعدل تدفق هواء حجمي 0.6-0.8 لتر / دقيقة) على الصفيحة الجراحية وحلق منطقة جلد البطن. امسح المنطقة المحلوقة ب 3X 75٪ من الإيثانول ثم بمحلول البيتادين.
   NOTE: راقب سلوك التنفس للفأر المخدر باستمرار. اضبط تركيز غاز الأيزوفلوران وفقا لنمط الاستنشاق والزفير للماوس.
10. تحقق من عدم وجود منعكس أخمصي عن طريق الضغط على كتائب المخلب الخلفية للفأر.
11. افتح تجويف البطن عن طريق إمساك الجلد بملقط قزحية منحنية (10 سم) وقطع الجلد على طول الخط الوسيط بمقص مستقيم من كربيد التنجستن (10 سم) ، ثم عن طريق الإمساك بالجدار البريتوني بملاقط دومون مستقيمة (12 سم ، 0.2 مم × 0.12 مم) وقطع الجدار على طول الخط باستخدام مقص فانا المستقيم (8 سم).
12. ضع قطعة من فيلم البارافين المغطى على فتحة البطن وثبت الفيلم على كلا الطرفين باستخدام ملقط مرقئ للبعوض الدقيق (12.5 سم ، منحني).
13. كشف قرون الرحم بجهاز يشبه الملعقة لتجنب تلف الأجنة داخل قرون الرحم. قم بتقطير بضع قطرات من PBS (37 درجة مئوية) على قرون الرحم وفحص الأجنة بحثا عن تلف أو تشوهات داخل كيس الرحم.
14. توثيق ترتيب وموضع الأجنة في قرون الرحم. اقلب الأجنة بحذر داخل كيس الرحم حتى يتم الوصول إلى الموضع المطلوب للحقن.
15. حقن 1-2 ميكرولتر من خليط AAV1-Fast-Green عن طريق الفحص البصري لموقع الحقن (مثل بطينات الدماغ) واختراق الصبغة تحت المجهر المجسم.
16. توثيق الأجنة المحقونة ووضع قرون الرحم مع الأجنة المحقونة مرة أخرى في تجويف البطن.
قم
17. بتقطير بضع قطرات من PBS (37 درجة مئوية) في تجويف البطن. أغلق التجويف عن طريق خياطة الجدار البريتوني (استخدم خيوط بحجم 6-0 من مادة البولي أميد) والجلد (استخدم خيوط بولي أميد بحجم 3-0) باستخدام ملقط مرقئ للبعوض من هالستيد (12.5 سم ، منحني). بدلا من ذلك ، استخدم نمطا متقطعا بسيطا أو خياطة / دبابيس من الفولاذ المقاوم للصدأ لإغلاق تجويف البطن والجلد.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 26Gx 1 '' إبرةHenke-Sass ، Wolf GmbH 410 وحدة التخدير لمضخة الهواءالأدوات الطبية الحيوية (Univentor) 8323102 النمط المصلي للفيروس المرتبط بالغدة 1 (AAV1) UKE (فيروسي المرفق الأساسي) - للحصول على المراجع والمجالات المستهدفة ل AAV1 ، انظر: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ وأيضا: نواقل توصيل الجينات المصممة: الهندسة الجزيئية وتطور النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة لتحسين نقل الجينات. كوون أنا ، شافر دي في. فارم Res. 2008 مارس; 25(3):489-99. تظهر النواقل الفيروسية المؤتلفة AAV ذات التنميط الكاذب مع قفيصة فيروسية من الأنماط المصلية 1 و 2 و 5 كفاءة تفاضلية وانتحاء خلوي بعد التسليم إلى مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. برجر C, Gorbatyuk OS, فيلاردو MJ, بيدن CS, ويليامز P, S Zolotukhin, PJ راير, ماندل RJ, Muzyczka N. مول. ثير. 2004 أغسطس; 10(2):302-17. تعمل ناقلات الفيروس المؤتلف المرتبط بالغدة (scAAV) التكميلية ذاتيا على تعزيز النقل الفعال بشكل مستقل عن تخليق الحمض النووي. مكارتي دي إم ، موناهان بي ، سامولسكي آر جيه. جين ثير. 2001 أغسطس; 8 (16): 1248-54.أدوات الطب الحيوي لمضخة الهواء(Univentor) Eheim 100 Aspirator Tune AssliesSigma-AldrichA5177-5EA قناع التنفس الفأر المؤكسد الألومنيومالأدوات الطبية الحيوية (Univentor) - BuprenorphineTemgesicampulesمسكن للألمالشعيرات الدمويةالعلوم - المنتجاتGB100TF-10معملاقط دومون حشوة (# 3 ، 12 سم ، مستقيم ، 0.2 × 0.12 مم) FST11203-23 ماكينة حلاقة كهربائيةفيليبس - خيوط إيثيكون (Ethilon ، 6-0 و 3-0) زيوت تشحيم العين Ethicon-polyamide Bepanthene- Fast GreenSigma-AldrichF7252لتصور السوائل المحقونة مفتاحتوجيه الغاز 4/2 موصلاتالأدوات الطبية الحيوية (Univentor) 8433020 ملقط مرقئ البعوض Halsted (12.5 سم ، مستقيم) FST13011-12 صندوق الحث للفئران بغطاء متحرك أفقيا ، الأبعاد الداخلية: LxBxH: 155x115x130 مم ، سمك الجدار: 6 ممأدوات طبية حيوية (Univentor) - ملقط القزحية (10 سم ، منحني ، مسنن) FST14007-14 مقص قزحية (11 سم ، مستقيم ، كربيد التنجستن) FST14501-14 Isofluran OP Tisch ، مسخن كهربائيا ، smالأبعاد الخارجية: 257 × 110 × 18 مم ، منطقة التسخين: 190 × 90 مم إزالة الأيزوفلوران من قناع التنفس الهروب لأسفل وفقا للوائحالأدوات الطبية الحيوية (Univentor)-إيزوفلوران (أتين) دينار أردني التخدير الاستنشاق الطبي المجهر الخفيف Basic DM ELeica-4x (NA 0.1 ∞ / -) ، 10x (NA 0.22 ∞ / 0.17) ، 40x (NA 0.65 ∞ / 0.17) ، 100x (NA 1.25 ∞ / 0.17) أهداف سحب الماصة الدقيقةالمنتجات العلميةP-97 ملقط مرقئ للبعوض (12.5 سم ، منحني) FST13010-12 Thermopuller P-97Sutter Instruments Tygon 6/4 مواد الأنابيب لتوصيل جميع الأجزاءالقطر الخارجي: 6 مم القطر الداخلي: 4 مم سمك الجدار: 1 ممأدوات طبية حيوية (Univentor) مقص Vannas (8 سم ، مستقيم) FST 15009-08