الحقن التجسيمي للهيدروجيل في نموذج فأر ما بعد السكتة الدماغية

الملخص

المصدر: Wilson, K.L., et al. حقن سقالات المواد الحيوية الهيدروجيل في الدماغ بعد السكتة الدماغية. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو الحقن التجسيمي للهيدروجيل في قلب السكتة الدماغية لفأر ما بعد السكتة الدماغية ، مما يسلط الضوء على دوره في تكوين السقالة التي تحاكي المصفوفة خارج الخلية ، وتعزز التسلل الخلوي ، وتدعم تكوين الأوعية ، مما يؤكد إمكاناتها العلاجية العصبية في التعافي من السكتة الدماغية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

حقن هيدروجيل أو مواد حيوية أخرى

1. قم بحقن المواد الحيوية في وقت يحدده المستخدم. في هذه التجربة ، تم إجراء الحقن بين 5 و 7 أيام بعد السكتة الدماغية. يتم حقن 2-6 ميكرولتر من الهيدروجيل.
   1. قم بتشغيل وسادة التسخين للحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس أثناء التخدير (37 درجة مئوية).
   2. قم بإعداد مقص معقم ، ملقط ، قطن ، مرهم عين بيطري ، غراء جراحي أو مادة خياطة ، كحول معقم ، ومناديل بيتا يود. قم بإعداد مثقاب العظام برؤوس مثقاب معقمة ومحاقن هاميلتون الزجاجية سعة 25 ميكرولتر بإبر معدنية 30 جرام.
   3. قم بتشغيل تعقيم الخرزة إلى 160 درجة مئوية للسماح بتعقيم الأدوات بين الفئران.
   4. قم بتوصيل مضخات الحقن بجهاز التجسيم. اضبط معدل التدفق على 1 ميكرولتر / دقيقة واضبط الحجم على 4 ميكرولتر.
   5. قم بإعداد قفص نظيف للفئران بعد الجراحة.
2. ضع الفأر في حجرة الحث بتركيز إيزوفلوران بنسبة 4٪ لتخديره حتى تتوقف الحركة العفوية ويصل تنفسه بمعدل بطيء وثابت.
   1. بمجرد النوم ، انقل الماوس وقم بتثبيته إلى الجهاز التجسيمي بتركيز إيزوفلوران للصيانة بنسبة 1.5٪.
   2. ضع مرهم العين البيطري على كلتا العينين.
   3. احلق أي فرو قد يكون قد نما مرة أخرى من رأس الفأر ، وقم بإعداد المنطقة بشكل معقم باستخدام منديل كحولي متبوعا بمنديل بيتا من اليود. كرر ثلاث مرات.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر ، استخدم منديلا إضافيا من الكحول في النهاية لتنظيف كل بيتا يود ، لأنه يسبب تهيج الجلد ويؤدي إلى حكة الفئران في جمجمتها بعد الجراحة.
3. باستخدام المقص الصغير و / أو الملقط ، أعد فتح الجلد فوق الدماغ. استخدم القطن مع محلول ملحي معقم أو PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) لتنظيف أي حطام من الجمجمة. ستكون دائرة بيضاء صفراء (السكتة الدماغية ، الشكل 1 ب) وثقب الأزيز من المثقاب. إذا كانت الأنسجة الميتة غير مرئية ، فمن المحتمل ألا تحدث سكتة دماغية. إذا لم يكن ثقب الأزيز متمركزا فوق السكتة الدماغية ، فأعد الحفر لتوسيطه.
4. قم بتوجيه مضخة الحقن فوق الماوس وقفلها عند 90 درجة. نظف المحقنة بمحلول ملحي معقم أو محلول PBS قبل إعادة تحميل المادة.
   1. بمجرد تنظيفها، قم بتفكيك المحقنة الزجاجية حتى لا تكون هناك إبرة. قم بتحميل المحقنة باستخدام ماصة إزاحة موجبة سعة 25 ميكرولتر مع 10 ميكرولتر من الهيدروجيل (أو أي مادة حيوية أخرى هنا مع الخلايا أو بدونها).
   2. باستخدام مكبس المحقنة ، ادفع الجل على طول الطريق إلى مقدمة المحقنة. ثم أعد تجميع المحقنة واستمر في الدفع حتى ينضح الجل بشكل واضح من الإبرة.
5. ضع المحقنة على المضخة. قد يلزم تعديل الجزء الخلفي من المضخة بحيث تتناسب المحقنة. اضبط معدل التدفق على 30 ميكرولتر / دقيقة ، وحدد سحب أو حقن حسب الاتجاه الذي يحتاج إلى التحرك فيه ، ثم اضغط على ابدأ. اضغط على إيقاف عندما يكون الجزء الخلفي من المضخة في المكان الصحيح.
   1. قم بربط الجزء الخلفي من المضخة بحيث تكون المحقنة آمنة. إذا تم إجراء التعديلات مسبقا ، فتأكد من ضبط معدل التدفق مرة أخرى على 1 ميكرولتر / دقيقة وضبطه على الحقن.
6. حرك المضخة في الاتجاهين x و y لتوجيهها فوق الفتحة. حرك المضخة لأسفل في الاتجاه z حتى تلامس إبرة المحقنة الجزء العلوي من الفتحة.
7. أعد ضبط Z على وحدة التحكم في العرض الرقمي. ثم حرك المحقنة لأسفل في الاتجاه z 0.750 مم. إذا انحنيت المحقنة أو كانت هناك مقاومة ، فإن الجمجمة إما تلتئم أو لم يتم حفرها بالكامل ، وتحتاج إلى إعادة الحفر.
8. اضغط على Start on the Console لحقن 4-6 ميكرولتر من الهيدروجيل بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة.
9. اضبط مؤقتا لمدة 5 دقائق عندما تتوقف المضخة عن الحقن للسماح للجل ببدء الربط المتقاطع.
10. بعد 5 دقائق ، اسحب المحقنة ببطء عن طريق تدوير z-nob. راقب لمعرفة ما إذا كانت أي مادة قد تم سحبها أو تسربها عن طريق الخطأ من الحفرة. افتح المضخة وانقلها بعيدا عن الماوس عندما تكون الإبرة بعيدة بما يكفي عن الجمجمة.
11. باستخدام الملقط أو الغراء الجراحي أو الغرز ، أغلق الجلد فوق الرأس. ضع الماوس في القفص النظيف وراقب تعافيه. يجب أن يستغرق الأمر حوالي 5-10 دقائق حتى يتعافى الفأر من التخدير.

النتائج

فئة الشكل = 'صورة image_resized image-style-align-center' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: التمثيل التخطيطي ل bregma وتوطين السكتة الدماغية. (أ) تلتقي الفصوص الجددارية في الأعلى لتشكيل البريجما. كان موضع الليزر في المنتصف على بعد 2.0 مم يسار من البريجما. (ب) شوهد تأكيد بصري للسكت...

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 25uL Hamilton Syringe 702RN ، لا إبرةFishcer Scientific14824663المحاقن المستخدمة لحقن المواد الحيوية25uL ماصة الإزاحة الإيجابيةGilsonM-25 منصة المرحلة القابلة للتعديلKopf الأدوات901 C57BL / 6 مختبر الفئرانجاكسون6648-12 أسبوعا من العمرتجميع القفص روبثورلابسER3-P43 "طويل ، قطر 6 مم ، 4 عبوات - لربط الليزر بمسحات القطن sterotaxVWR89031-288 CP 25 نصائح ماصةجيلسونF148012 لوحة تسخينKopf الأدواتHP-4M IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia CenterVetEquip901808 Jewlers Corpps # 5GFS chemicals46085 Miltex Adson Dressing Corps ، Disecting GradeIntefra MiltexV96-118 مضخة صغيرة متغيرة التدفقتوماس Scientific70730-064مضخة ل ترويةالماوس غاز التخدير حامل الرأسKopf Instruments923-B صندوق التحكم النفاث النانويChemyx10050 رأس مضخة NanojetChemxy10051نعلق على جهاز تجسيمي لحقن المواد الحيويةإبرة RN 30G PT STY 3 ، 0.5 بوصةFishcer ScientificNC9459562 قضبان أذن غير قابلة للتمزق 60ºKopf Instruments922 Puralube Vet OintmentDr. Foster Smith9N-76855 Rectal Probe MouseKopf InstrumentsRet-3-ISO Sol-M U-100 Insuline مع علامات 1/2 وحدة 0.5 ملVWR10002-726لحقن نظام تلطيخ الشريحة StainTray الورديالبنغالي Simport ScientificM920-2لتلوين الشرائحجهاز SterotaxicKopf Instruments940أداة تجسيمية للحيوانات الصغيرةملقط الطالب Adson Fluid -1x2 أسنانأدوات العلوم الدقيقة91127-12 ملقط دقيق للطلاب - سيقان مستقيمة /عريضة أدوات العلوم الدقيقة91113-10 تحكم في درجة الحرارةKopf InstrumentsTCAT-2LVمركب Tissue-Tek OCTVWR25608-930 Vetbond Tissue Adhessive 3 ملسانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةsc-361931