بناء واجهة العصب المحيطي المتجددة المركبة في نموذج الفئران لإصابة الأعصاب

Abstract

المصدر: Svientek، S. R.، et al. تصنيع واجهة العصب المحيطي المتجددة المركبة (C-RPNI) في الفئران البالغة. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو البناء الجراحي لواجهة العصب المحيطي التجديدية المركبة (C-RPNI) في نموذج الفئران لإصابة الأعصاب الطرفية. يتضمن الإجراء ربط عصب شظوي متقاطع بطعم عضلي وتغطيته بتطعيم جلدي لتعزيز تجديد الأعصاب. بمرور الوقت ، تعيد الخلايا العصبية الحركية والحسية إنشاء الروابط داخل الطعوم ، مما يتيح تكوين هياكل عصبية عضلية وحسية وظيفية.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

ملاحظة: يسمح للفئران المانحة بالوصول المجاني إلى الطعام والماء قبل إجراءات التبرع بالجلد والعضلات. يتم إجراء القتل الرحيم تحت التخدير العميق متبوعا بحقن كلوريد البوتاسيوم داخل القلب بطريقة ثانوية لاسترواح الصدر الثنائي. يمكن نظريا استخدام أي سلالة من الفئران مع هذه التجربة. ومع ذلك ، فقد حقق مختبرنا نتائج متسقة في كل من ذكور وإناث فئران Fischer F344 (~ 200-250 جم) في عمر شهرين إلى أربعة أشهر. يجب أن تكون الفئران المانحة متساوية الجين للفئران التجريبية.

1. تحضير الطعم الجلدي

1. تخدير الجرذ المتبرع في غرفة الحث باستخدام محلول 5٪ إيزوفلوران في الأكسجين عند 0.8-1 لتر / دقيقة. بمجرد تخدير الفئران ، أخرجه من غرفة الحث وضعه على مخروط أنف لإعادة التنفس ، وخفض الأيزوفلوران إلى 2-2.5٪ للحفاظ على التخدير.
2. تطبيق محلول 0.02-0.03 مل من الكاربروفين (50 ملغ/مل) في 0.2 مل من محلول ملحي معقم تحت الجلد بين لوحي الكتف لعلاج التسكين.
3. ضع مرهم الدموع الاصطناعي على كلتا العينين لمنع تقرحات القرنية.
4. باستخدام المقص ، احلق الطرف الخلفي السفلي بالكامل ، ومنطقة الكاحل ، وجوانب الكفوف (الكفوب).
5. قم بتنظيف الطرف الخلفي والسطح الأخمصي المختار من المخلب بالكحول ، متبوعا بمحلول اليودوبوفيدون ، وينتهي بالتطهير النهائي بالكحول لإزالة اليودوبوفيدون المتبقي.
6. باستخدام مثقاب عالي السرعة بمحرك صغير محمول باليد مع حجر تلميع دائري ناعم قابل للإزالة (4000 دورة في الدقيقة) ، قم بإزالة السطح الأخمصي للمخلب لإزالة البشرة. أثناء الحفر ، ضع قطرات من المحلول الملحي حتى لا تحرق الجلد. سيكون للأدمة الأساسية مظهر لامع مع نزيف دقيق.
7. ضع عاصبة على الطرف السفلي لإبطاء تدفق الدم.
8. قم بإزالة الجلد الأخمصي بحدة باستخدام مشرط # 15 وضعه في شاش مبلل بالمحلول الملحي لمنع الجفاف. ستتم إزالة بعض الأنسجة الوترية والضامة بطبيعتها مع الجلد في هذه الخطوة وستتم إزالتها لاحقا.
9. ضع غلاف شاش على القدم النازفة لإبطاء النزيف. كرر الخطوات 1.5-1.9 إذا قمت بإنشاء بناءين.
10. تحت المجهر (تكبير 20x) ، قم بإزالة النسيج الوتري والضام من الطبقة العميقة من طعم الجلد باستخدام مقص دقيق. احرص على عدم إحداث ثقوب في الكسب غير المشروع. يجب أن يكون الطعم الجلدي الرقيق معتما قليلا ويحتوي على أدمة فقط ، ويبلغ حجمه حوالي 0.5 سم × 1.0 سم.
11. ضعها في شاش مبلل بالمحلول الملحي حتى تصبح جاهزة لتصنيع C-RPNI. يجب استخدام الطعوم في غضون ساعتين من الحصاد.

2. تحضير الكسب غير المشروع العضلي

1. قم بعمل شق طولي على طول الجانب الأمامي للطرف الخلفي السفلي من أعلى الكاحل مباشرة إلى أسفل الركبة مباشرة بمشرط # 15. تشريح الأنسجة تحت الجلد لكشف العضلات الأساسية.
2. في الجانب البعيد من الشق ، قم بكشف الإدخالات الوترية لعضلات الطرف السفلي. عادة ما يكون الظنبوب الأمامي (TA) هو الأكبر والأكثر أمامية من العضلات ، وأسفل هذه العضلة وخلفها مباشرة يقع الباسطة اللاصقة الطويلة (EDL). عزل وتر EDL البعيد عن الأوتار الأخرى في المنطقة ، مع الحرص على عدم شق إدخاله في هذه المرحلة.
3. تأكد من عزل الوتر الصحيح عن طريق إدخال كلا سنين الملقط تحت الوتر وممارسة الضغط التصاعدي عن طريق فتح الملقط لإحداث خروج الوتر. يجب أن يتسبب التلاعب بهذا الوتر في تمدد جميع أصابع القدم في وقت واحد.
4. قم بإجراء بضع الوتر البعيد باستخدام مقص القزحية الحاد وافصل العضلات عن الأنسجة المحيطة بصراحة باستخدام بضع الوباء (أو مقص آخر ذو رأس حاد) ، واعمل بشكل قريب للعثور على الأصل الوتري.
5. بمجرد تصور الوتر القريب ، قم مرة أخرى بإجراء بضع الوتر باستخدام مقص القزحية الحاد. ضع طعم العضلات في شاش مبلل بالمحلول الملحي لمنع الجفاف.
6. بمجرد إزالة جميع الطعوم المرغوبة من فأر متبرع ، قم بالقتل الرحيم بشكل أساسي عن طريق حقن KCl داخل القلب (1-2 mEq K + / kg) متبوعا بالقتل الرحيم الثانوي مع استرواح الصدر الثنائي بشفرة # 15.

3. العصب الشظوي المشترك: عزل وتحضير

:

1. التخدير وتوفير التسكين للفئران التجريبية وفقا للبروتوكول الموضح في الخطوات 1.1-1.3.
2. احلق الفخذ المطلوب ونظفه بالكحول والبيتادين وانتهي بالكحول لإزالة آثار البيتادين.
3. انقل من طاولة التحضير الجراحي إلى طاولة المجهر الجراحي وضعه على وسادة تسخين مع مسبار درجة حرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. حافظ على الأيزوفلوران عند 2-2.5٪ والأكسجين عند 0.8-1 لتر / دقيقة.
4. ضع علامة على الشق ، الممتد من الشق البعيد إلى الشق الوركي إلى الجزء السفلي من الركبة. يجب أن تكون هذه العلامة أدنى من عظم الفخذ وزاوية بعيدة عنها. قم بعمل شق بشفرة # 15 ، مع شق اللفافة الأساسية للعضلة ذات الرأسين الفخذية.
5. قم بتشريح العضلة ذات الرأسين الفخذية بعناية باستخدام مقص صغير أو مقص ذو رأس حاد إلى الفراغ الكامن وراء العضلة ذات الرأسين الفخذية.
   ملاحظة: يتحرك العصب الوركي تقريبا في نفس اتجاه الشق الأولي الذي تم إجراؤه. هناك ثلاثة فروع ، عادة مع العصب الخلفي والعصب الشظوي والظنبوبي المشترك الذي ينتقل بشكل سطحي وعميق إلى الركبة ، على التوالي.
6. بعد تحديد العصب الشظوي المشترك (CP) ، باستخدام زوج من الملقط الدقيق وذو الرؤوس الدقيقة والمقص الدقيق ، قم بعزل عصب CP بعناية عن الفروع الوركي الأخرى وإزالة أي نسيج ضام باق بعيدا.
7. عند النقطة التي يعبر فيها العصب سطح الركبة ، قم بعبور العصب بحدة باستخدام مقص دقيق.
   ملاحظة: يعد استخدام المقص الحاد أمرا مهما للغاية في هذه الخطوة ، لأن التسبب في صدمة كبيرة للعصب يمكن أن يزيد من خطر تكوين الورم العصبي.
8. حرر بعناية أي نسيج ضام متبقي من عصب الشلل الدماغي واعمل بشكل قريب لتحرير العصب بطول 2 سم تقريبا.

4. تصنيع بناء C-RPNI

:

1. قم بإزالة الطعم العضلي من الشاش المبلل بالمحلول الملحي وإزالة جميع الأنسجة الوترية المركزية بالإضافة إلى جزء مركزي صغير من epimysium. اترك النهايات الوترية سليمة.
2. باستخدام 8-0 خياطة النايلون ، قم بتأمين epineurium للطرف المتقاطع لعصب CP إلى منطقة الكسب غير المشروع العضلي الخالية من epimysium مع غرزتين متقطعتين على جانبي العصب.
3. قم بتأمين طعم العضلات في سمحاق عظم الفخذ بغرزة واحدة متقطعة من النايلون 6-0 بشكل قريب وبعيد ، مع توجيه تقاطع الأعصاب العضلي بعيدا عن عظم الفخذ.
   ملاحظة: قم بتأمين العضلات بحيث تكون في طول طبيعي ومريح. حاول ألا تمد العضلات بشكل كبير أو تترك الكثير من التراخي عند التأمين.
4. ضع 8-0 غرزة النايلون في الهامش السفلي المركزي للطعم العضلي epimysium ، وتثبيته في epineurium العصب الشلل الدماغي بطريقة تخلق تراخي في العصب داخل الطعم العضلي وتساعد على تخفيف أي توتر مستقبلي قد يتعرض له مع التجوال في وقت لاحق.
5. قم بإزالة طعم الجلد من الشاش المبلل بالمحلول الملحي ورتبه على الطعم العضلي بطريقة تغطي العصب وغالبية العضلات بالكامل. تأكد من أن الهامش العميق للأدمة يستقر على العضلات. تقليم أي أدمة تمتد إلى ما وراء حدود العضلات.
6. قم بتأمين طعم الجلد في طعم العضلات بشكل محيطي باستخدام 8-0 قطع النايلون الغرز. عادة ، يتم استخدام 4-8 خيوط جراحية إجمالية اعتمادا على حجم البناء.
7. أغلق اللفافة ذات الرأسين الفخذية فوق البناء بطريقة تشغيل باستخدام خياطة كرومية 5-0.
8. أغلق الجلد المغطى بخياطة 4-0 كرومية في طريقة الجري.
9. امسح المنطقة الجراحية بقطعة كحول واستخدم مرهم مضاد حيوي.
10. توقف عن التخدير الاستنشاقي واسمح للفأر بالتعافي بمصادر الغذاء والماء المنفصلة عن زملائه في القفص.

Materials