نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول لتنفيذ يعيش تلطيخ الخلايا التي يمكن استخدامها لاكتشاف مستقبلات الرائحة على سطح الخلايا HEK293T مريح. بالإضافة ، يمكن أيضا استخدامه لفحص للتعبير عن سطح حسي كيميائي أخرى أو مستقبلات GPCRs.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
معايرة تعبير حسي كيميائي السطحية من المستقبلات في خلايا غيروي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ومن المعترف به في العالم حيا على الروائح من شعور الشم. وتوسط في الفئران عن طريق الشم ذخيرة من حوالي 1200 غرام بروتين المستقبلات اقترن (GPCRs) 1 التي افترض لربط جزيئات الرائحة المتطايرة وتحويل الإشارة إلى إشارة خارج الخلية داخل الخلايا بواسطة اقتران مع G Gαolf البروتين. الملزم للodorants إلى المستقبلات ويعتقد اتباع القاعدة اندماجي ، وهذا هو واحد قد ربط مستقبلات الرائحة واحد عدة مستقبلات قد ربط odorants عدة بدرجات متفاوتة 2. وقد الكيمياء الحيوية ، ويشير الى والدراسات ملزم يجند قامت بها مريح بالنسبة لمعظم GPCRs باستخدام الخلايا مغاير. ويمنع استخدام الخلايا لكن غيري لدراسة مستقبلات الرائحة ، لفترة طويلة منذ ذلك الحين على ترنسفكأيشن فشلوا في تصديرها إلى السطح. وقد أثبتت سايتو وآخرون واحد تمرير مستقبلات الغشاء نقل البروتين (RTP) المحرمين الأسرة اظهار التعبير المعززة في الخلايا العصبية الحسية الشمية ويكون بمثابة مرافقين لمستقبلات الرائحة الحركة على السطح في الخلايا مغاير ، عندما شاركت transfected معا 3. لتنفيذ فحوصات البيوكيميائية لمستقبلات باستخدام الخلايا مغاير ، يجب على المرء أولا تحديد إذا كانت قوية التعبير مستقبلات يظهر على سطح الأرض في خط الخلية. يمكن أن يعاير هذا عن طريق المستقبلات مع RTP1S كوصي تليها الخلية الحية تلطيخ لتسمية fluorescently المجال خارج الخلية أو علامة A في المجال حصرا overexpressing خارج الخلية. نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول لتنفيذ يعيش تلطيخ الخلايا التي يمكن استخدامها لاكتشاف مستقبلات الرائحة على سطح الخلايا HEK293T مريح. بالإضافة ، يمكن أيضا استخدامه لفحص للتعبير عن سطح حسي كيميائي أخرى أو مستقبلات GPCRs.
البروتوكول
1. الإجراء :
الإجراء يتألف من ثلاثة أجزاء على مدى فترة زمنية الانتهاء مجموعه 3 أيام : نقل الخلايا ، وترنسفكأيشن كيمياء سيتولوجية مناعية ، خطوة واحدة نفذت في اليوم الواحد. يجب أن يتم نقل وترنسفكأيشن من الخلايا على مدى اليومين الأولين في ظروف معقمة في غرفة تدفق الصفحي.
اليوم 1 : نقل الخلايا HEK293T للمقايسة التعبير السطح.
- نقل متوسطة (M10) : ميكس المتوسطة الأساسية الدنيا تستكمل مع 10 ٪ (من حيث الحجم) مصل بقري....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يجب أن تتم كل خطوة بعناية لضمان بارزة ومميزة تلطيخ السطح. يجب أن تتم العملية بأكملها في تلطيخ الباردة (على الجليد) ، ويجب تبريد الدرج الذي وضعت غطاء ينزلق قبل استخدامها لضمان بقاء الخلايا على قيد الحياة. وعلاوة على ذلك يتم تثبيت في نهاية السطح عملية التلوين. هذا في تناقض حاد مع تلوين الداخلية حيث تسبق التثبيت لتلطيخ permeabilize غشاء الخلية إلى أجسام الابتدائية والثانوية. يجب التقليل من وقت التعرض للزلات لتغطية الجوية لمنع الخلايا من تجفيف ؛ طبقات بالتالي ينزلق الغطاء مع حلول الأض.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ونحن نشكر أعضاء المختبر ماتسونامي لقراءة نقدية لهذه المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| غطاء شريحة 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| مصل بقري جنيني | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| وسط أساسي أدنى | Sigma-Aldrich | M4655 | مع L glutamate، وملح Earle’s وبيكربونات |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| بارافورمالدهيد | EMS | 19208 | |
| محلول هانكس الملح المتوازن (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | مع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم |
| محلول منظم HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | بدون كالسيوم ومغنيسيوم |
| هيدروبروميد Poly D Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| أزيد الصوديوم | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| طبق زراعة أنسجة 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
المراجع
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
