التصوير المضيء بيولوجيا لتطور ورم الثدي في نموذج أنثى الفأر

الملخص

مصدر:
مارينا أرانتيس راديتشي¹ ، فيكتور كارلوس ميلو¹ ،
فيكتوريا باز ماتشادو¹, مارسيا كريستينا أوليفيرا دا روشا¹, جاكلين فاز دي أوليفيرا¹, لوانا كريستينا كامارغو^1,2, لويس ألكسندر مولمان¹, ريكاردو بينتيس أزيفيدو¹, سونيا ناير باو¹, جواو باولو فيغيرو لونغو<sup>1

1</sup>معهد العلوم البيولوجية ، جامعة برازيليا ، ²قسم العمليات النفسية الأساسية ، معهد علم النفس ، جامعة برازيليا

يوضح هذا الفيديو إجراء تتبع تطور الورم في الجسم الحي عن طريق حقن خلايا سرطان الثدي الغدي المعبرة عن اللوسيفيراز في أنثى الفأر ومراقبة إشارات الإضاءة الحيوية لتقييم نمو الورم الأولي والنقيلي بمرور الوقت

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. ثقافة الخلية

1. حافظ على خط الخلايا 4T1 (ATCC-CRL-2539) ، وهي خلية سرطان غدي في الثدي في الفئران ، في مزرعة مع وسط DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco) مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني (v: v) ، وبنسلين (100 وحدة / مل) ، وستربتومايسين (100 وحدة / مل) ، عند 37 درجة مئوية وفي جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
2. قم بنقل خط الخلية الأصلي باستخدام جين Luc2 ، الذي يعبر عن لوسيفيراز. يتم إنتاج هذا الإنزيم المضيء بيولوجيا بشكل أساسي.

2. نموذج - زرع الخلايا السرطانية

1. قم بتلقيح خلايا 4T1 المضيئة بيولوجيا ومعبرة عن اللوسيفيراز تحت الجلد (2 × 10⁵ خلايا لكل فأر) في الظهر الأيسر لأنثى الفئران Balb / c تحت التخدير (الكيتامين والزيلازين بمعدل 80 مجم / كجم و 10 مجم / كجم ، على التوالي).
   1. في هذا الإجراء ، قم بتخدير الفأر قبل التجربة باستخدام الحقن داخل الصفاق لعوامل التخدير المحددة (الكيتامين والزيلازين بجرعة 80 و 10 مجم / كجم ، على التوالي).
   2. بعد 5 دقائق من تحريض التخدير ، احلق الفأر وحقن الخلايا تحت الجلد باستخدام محاقن الأنسولين سعة 1 مل.
      ملاحظة: تم استخدام ما مجموعه خمسة فئران عمرها 8 أسابيع ، تزن كل منها حوالي 25 جراما ، لتحريض الورم والتصوير.
2. لقياس نمو الورم في الجسم الحي ، قم بتقييم الفأر الحامل للورم عن طريق التصوير المضيء الحيوي ، من خلال مراقبة نمو الورم لمدة 4 أسابيع.
   1. لتجارب التصوير الحيوي ، قم بتخدير الفأر بالأيزوفلوران (2.5٪ مخفف في الهواء المضغوط النقي). لتقييم تطور الورم ، قم بتصوير الفأر مرة واحدة في الأسبوع لمدة 4 أسابيع باستخدام معدات تقيس إشارات الإضاءة الحيوية.
      ملاحظه: تم استخدام إشارة 4T1-luc luciferase bioluminescent كمعلمة لتقييم النمو والإشارة إلى تطور الورم.
3. أثناء عملية التصوير ، ضع الفأر في وضع راقد ظهري داخل المنطقة المحددة من الجهاز لالتقاط الصور المضيئة بيولوجيا.
4. بعد التخدير، يتم حقن الفأر ب D-luciferin (100 ميكرولتر؛ 15 ملغم/مل) داخل الصفاق.
   ملاحظه: نظرا لأن D-luciferin عبارة عن ركيزة لإنزيم لوسيفيراز ، الذي ينتج فوتونات ضوئية عند شقها ، وتعبر خلايا لوسيفيراز 4T1-bioluminescent عن هذا الإنزيم بشكل أساسي ، فتقوم بتحديد الورم واكتشافه في الحية.
5. لاكتشاف الإشارات، التقط 20 صورة مضيئة بيولوجيا على مدار 20 دقيقة لكل في كل نقطة نهاية. تمثل كل صورة من هذه الصور إشارة الإضاءة الحيوية المنبعثة على مدى 60 ثانية.
6. قم ببناء منحنى حركية مضيئة بيولوجيا يمثل الإشارة المنبعثة كل دقيقة. لضمان أفضل النتائج لكل ، سجل الحد الأقصى لانبعاث الإضاءة الحيوية لكل نقطة نهاية.
7. لالتقاط صورة التلألؤ البيولوجي ، استخدم المعلمات التالية: مرشح الانبعاث مفتوح ، بدون إثارة ، binning 8 ، f / stop 2 ، ومجال الرؤية من النوع D. لإنشاء منحنى نمو ، قم بتصوير مرة واحدة في الأسبوع لمدة 4 أسابيع.
8. تصوير التلألؤ البيولوجي - ورم ورم أولي ورم خبيث في الرئة.
   1. للتمييز بين إشارات ورم خبيث أولية في الرئة، حدد مناطق محددة ذات أهمية باستخدام برنامج الجهاز.
   2. تحديد الإشارات المضيئة بيولوجيا في موقع الحقن والمنطقة الصدرية حيث انتشرت الخلايا. بناء على هذه الصور ، احسب تقدم إشارة الإضاءة الحيوية ، والتي ترتبط ارتباطا وثيقا بتطور الورم.
   3. باستخدام الصور التي تم جمعها على مدار عدة أسابيع، قم بإنشاء ملف تعريف حركية النمو لمواقع الورم المختلفة، بما في ذلك الورم الأساسي والآفات النقيلية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
د-لوسيفيرين	بيركين إلمر	122799	كاشف كيميائي
ميديم النسر المعدل من دولبيكوس	جيبكو	أ7030	وسائط زراعة الخلايا
مصل الأبقار الجنينية	ميرك	إف 2442	مكمل وسائط ثقافة الخلية
إيزوفلوران	كريستاليا	NA	المسكنات
IVIS لومينا	إكس آر	السلسلة الثالثة	معدات - الولايات المتحدة الأمريكية
بنسلين	ميرك	ص 4333	المضاد الحيوي لثقافة الخلايا
فالويدين أليكسا فلور 488	ثيرمو فيشر	أ 12379	كاشف كيميائي
محلول ملحي عازلة للفوسفات	ميرك	4437568	كاشف كيميائي
الستربتومايسين	ميرك	ص 4333	المضاد الحيوي لثقافة الخلايا