مقالة منهجية

عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين

DOI:

10.3791/2462

⸱

فبراير 3, 2011

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Washington School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف طريقة لتحضير شرائح الحصين عضوي النمط التي يمكن تكييفها بسهولة إلى مناطق أخرى من الدماغ. وضعت شرائح الدماغ على الأغشية التي يسهل اختراقها وسائل الاعلام الثقافة يسمح له شكل واجهة. هذا الأسلوب يحافظ على بنية الإجمالي للقرن آمون لمدة تصل الى 2 أسابيع في الثقافة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قرن آمون ، وهو مكون من الجهاز الحوفي ، ويلعب دورا هاما في الذاكرة طويلة المدى والملاحة الفضائية 1. يمكن أن الخلايا العصبية الحصين تعديل قوام صلاتهم بعد فترات وجيزة من تفعيل قوي. ويمكن لهذه الظاهرة ، والمعروفة باسم بعيدة المدى (الكمونية) تستمر لساعات أو أيام ، وأصبحت آلية أفضل مرشح للتعلم والذاكرة 2. بالإضافة إلى ذلك ، بذلت التشريح محددة جيدا ، والتواصل بين الحصين 3 أنه نظام نموذجي لدراسة نقل الكلاسيكية متشابك ومتشابك 4 اللدونة.

كما فهمنا للعلم وظائف الأعضاء من نقاط الاشتباك العصبي الحصين نما وأصبح اللاعبون الجزيئية التي تم تحديدها ، وأصبح من الضروري التعامل مع البروتينات متشابك حتمية. ثقافات الحصين عضوي النمط توفر إمكانية للتلاعب الجيني سهلة ودقيقة ولكن التدخل الدوائي الحفاظ على منظمة متشابك التي تعتبر ضرورية لفهم وظيفة المشبك في سياق طبيعي أكثر من الأساليب الروتينية ثقافة فصل الخلايا العصبية.

هنا نقدم طريقة لتحضير شرائح الحصين والثقافة التي يمكن تكييفها بسهولة إلى مناطق أخرى من الدماغ. هذا الأسلوب يتيح سهولة الوصول إلى شرائح للتلاعب الجيني باستخدام أساليب مختلفة مثل العدوى الفيروسية أو 5،6 biolistics 7. بالإضافة ، يمكن استردادها بسهولة لشرائح فحوصات البيوكيميائية 8 ، أو نقلها إلى المجاهر التصوير 9 أو 10 تجارب الكهربية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. قبل البدء في إعداد شرائح الحصين.

  1. إعداد تقطيع الأنسجة عن طريق وضع قطعة من ورقة تفلون وتصاعد شفرة جديدة.
  2. مسح نسيج الثقافة (TC) هود مع الايثانول 70 ٪ ومجموعة الداخل مجهر تشريح. تعقيم هود ، المجهر ، وتقطيع اللحم والأنسجة وتشريح جميع الصكوك لمدة 15 دقيقة للأشعة فوق البنفسجية.
  3. إعداد ست لوحات TC جيدا. إضافة 750 ميكرولتر ثقافة شريحة وسائل الإعلام (SCM) في مكان جيد وإدراج ثقافة خلية في كل بئر. تأكد من الأغشية الرطبة تماما مع عدم وجود فقاعات تحتها. وضع لوحات في حاضنة على 35 درجة مئوية بالغاز مع 5 ٪ CO 2 لحين الحاجة إليها.
  4. صب 50 مل + ACSF منخفضة نا (تشريح الحل) في كوب 100 مل ووضعه على الجليد الملح المزيج. فقاعة المنخفض الصوديوم + ACSF مع 5 ٪ CO 2 / 95 ٪ O 2 حتى يتغير لونها وACSF أشكال مزيج من الطين حل المجمدة والسائلة (10-20 دقيقة).
  5. الحصول على الفئران P5 - P7 الجرو. ويمكن استخدام ما يصل الى ثلاثة الجراء.

2. الحصين شرائح التحضير.

  1. قطع رأس الحيوان مع مقص أداة حادة. قطع الجلد وفضح الجمجمة. فتح الجمجمة عن طريق قطع من جانب إلى آخر على طول خط interaural ومن ثم على طول الدرز السهمي مع مقص صغير. ويمكن إجراء خفض اختياري من جانب إلى آخر في الجبهة لتسهيل إزالة العظام والتعرض للدماغ. يستخرج الدماغ بسرعة مع ملعقة ملعقة صغيرة مدورة ووضعه في الطين من تشريح حل البرد لمدة دقيقة 1 ~. ~ صب 10 مل من محلول الباردة الجليد تشريح على طبق 60 ملم ونقل الدماغ من الدورق إلى الطبق. ينبغي تغطية تشريح الدماغ مع الحل.
  2. تحت المجهر تشريح : ضع الدماغ والاحتفاظ بها في خط الوسط مع ملقط تشريح الضغط إلى أسفل الطبق 60 ملم. استخدام أداة تشريح الحصين للفصل بين نصفي الكرة الأرضية تاركة الدماغ المتوسط. ويتعرض بعد ذلك الحصين على كل الكرة الأرضية. ثم بلطف الحصين مغرفة بها مع تشريح الحصين الأداة. استخدام إبرة تشريح لعزل تماما الحصين وتنظيفه قدر المستطاع.
  3. استخدام غيض مقصوص من طرف P1000 ماصة التصفية ، نضح بلطف الحصين وتحويلها إلى ورقة تفلون على تقطيع اللحم والأنسجة. موقف الحصين على جانبها مقعرة.
  4. محاذاة عمودية الحصين لنصل للحصول على مقاطع الاكليلية واستنزاف فائض السائل.
  5. الحصين كل شريحة ميكرون 400.
  6. ~ صب 10 مل الباردة المجلس الاعلى للقضاة في صحن 60 ملم ونقل شرائح الحصين من تقطيع اللحم وباستخدام آخر مقصوص P1000 طرف مرشح المجلس الاعلى للقضاة والباردة. تجنب جعل فقاعات.
  7. مع مساعدة من ملعقة ملعقة والقزحية مباشرة منفصلة بلطف شرائح من بعضها البعض.
  8. شرائح منفصلة واضحة المعالم وغير التالفة من الشرائح المتضررة.

3. الحصين شرائح الثقافة

  1. تقديم لوحات ستة جيدا مع المجلس الاعلى للقضاة وإدراج ثقافة خلية من الحاضنة. مع مساعدة من طرف آخر P1000 مقصوص تصفية ونقل الشرائح الفردية على الغشاء. مكان شرائح 4-5 في الغشاء. يجب الحرص على عدم وضع الشرائح وثيقة إما إلى الجدار إدراج أو قريبة من بعضها البعض. عند الضرورة ، واستخدام ملعقة لقزحية شرائح منفصلة. إزالة الزائدة المتوسطة. شرائح اتصال أقل قدر ممكن مرة واحدة كانت على الغشاء.
  2. تحرك الصفيحة العودة إلى الحاضنة والثقافة في 35 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
  3. SCM تغيير كل 48 ساعة داخل غطاء TC بواسطة الشفط مع المجلس الأعلى للقضاء ماصة باستور. إضافة 750 ميكرولتر من قبل المجلس الاعلى للقضاة تحسنت جديدة لكل بئر. تأكد من أن يتم تشكيل أي فقاعات تحت الغشاء.

4. الحلول

  1. انخفاض الصوديوم + ACSF -- حل تشريح للثقافات شريحة
    منزوع الأيونات ومعقمة لإضافة H 2 O :
    ل 500 مل ل 1000 مل التركيز النهائي
    CaCl 2 (1 م) 0.5 مل 1 مل 1 ملم
    D - غلوكوز 0،901 ز 1،802 ز 10 ملي
    بوكل 0،149 ز 0،298 ز 4 ملم
    MgCl 2 (1 م) 2.5 مل 5 مل 5 ملم
    NaHCO 3 1،092 ز 2،184 ز 26 مم
    السكروز 40 غ 80 غ 234 ملي
    محلول الفينول الأحمر 0.5 ٪ في DPBS 0.5 مل 1 مل 0.1 ٪ V / V

    مزيج ~ 30 دقيقة
    Sterilإيزي قبل المرور عبر فلتر 0.22μm
    جعل aliquots 50 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية لا تزيد على 2 أشهر.
  2. شريحة متوسطة الثقافة (SCM)
    ل 500 مل ل 1000 مل التركيز النهائي
    MEM النسر المتوسطة 4.2 غرام 8.4 غرام 8.4 غرام / لتر
    حصان المصل الحرارة المعطل 100 مل 200 مل 20 ٪
    L - الجلوتامين (200 ملم) 2.5 مل 5 مل 1 ملم
    CaCl 2 (1 م) 0.5 مل 1 مل 1 ملم
    MgSO 4 (1 م) 1 مل 2 مل 2 ملم
    الانسولين (1 ملغ / مل) ، الذائب في حمض الهيدروكلوريك 0.01 N 0.5 مل 1 مل 1 ملغم / لتر
    حمض الاسكوربيك ، والحل (25 ٪ W / V) 0.024 مل 0.048 مل 0.00125 ٪
    D - غلوكوز 1.16g 2.32g 13 ملم
    NaHCO 3 0.22g 0.44g 5.2 ملي
    Hepes 3.58g 7.16g 30 ملم

    مزيج حتى حل شامل وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة.
    ضبط الرقم الهيدروجيني ل7،27-7،28 مع هيدروكسيد الصوديوم N 1
    قياس الأسمولية. ضبط إلى 320 ملمول / كغ مع منزوع الأيونات ومعقمة O. 2 H ويتوقع أن تضيف ما يقرب من 25-40 مل. الأسمولية الاختيار مرة أخرى.
    *** الحموضة قد تتغير قليلا حين تعديل الأسمولية ، وهذا على ما يرام ، فإنه من المهم أن الأسمولية في النطاق الصحيح (317-323).
    تعقيم قبل المرور عبر فلتر 0.22 ميكرون.
    جعل aliquots 20 مل وتخزينها لمدة تصل إلى 2-3 أسابيع في 4 درجات مئوية.
    Gluatamine المخزون : إعداد عند تركيز 200 ملم ومخزن في -20 درجة مئوية في aliquots من 2.5 مل.
    حمض الاسكوربيك الأسهم : إعداد بتركيز 25 ٪ (W / V) وتخزينها في -20 درجة مئوية في aliquots من 100 ميكرولتر.

5. ممثل النتائج :

وينبغي أن ننظر شرائح بيضاء تحت نطاق تشريح دون بقع سوداء واضحة المعالم وغير التالفة CA1 ، CA3 ، والمناطق التلفيف المسنن. ويعتبر التلوث الجرثومي وبسهولة نقل بقع سوداء في المتوسط ​​أو تعكر المجلس الأعلى للقضاء. عند وضعها تحت المجهر ، يجب على سطح شريحة تبدو نظيفة بعد 4 أيام في الثقافة مع الهيئات واضحة وdiscernibly الخلية. إذا لم يكن هناك أجسام الخلايا واضحة وينظر الكثير من الحطام ويغطي السطح بعد 4 ايام ، ومن ثم لا شريحة صحية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويستند هذا الأسلوب على طريقة وصف لأول مرة من قبل Stoppini آخرون (11) وتقدم على نحو سريع لشرائح ثقافة الحصين. الجانب الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو الحفاظ على شرائح معقمة ، وبالتالي من الأهمية بمكان استخدام تقنيات مناسبة ومعقمة بشكل صحيح لتطهير وتعقيم جميع المواد في اتصال مع الأنسجة.

يمكن الأمصال مصادر مختلفة تؤثر على نوعية الشرائح. نوصي اختبار عدة دفعات الأولى. إذا كان التلوث هو مشكلة متكرر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل NINDS -- NIH R01NS060756

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أغشية إدخال زراعة الخلاياEMD MilliporePICM03050
أطباق بـ 6 آبارBD Biosciences353046
جهاز تقطيع الأنسجةStoelting Co.51425/51415
مجهرOlympus CorporationSZX7-ILLD2-100
أداة تشريح الحصينF.S.T.10099-15
مقصات خدمات عامة كبيرة. PerfectionF.S.T.37500-00/37000-00 لليمنى/اليسرى
ملعقة قزحيةF.S.T.10093-13
ملعقة مستقيمةF.S.T.10094-13
ملعقة دقيقة ذات رأس مستديرVWR international57949-039
إبرة تشريح أحادية الحافة القاطعةElectron Microscopy Sciences72946
ملاقط تشريحDumont#2
مقصات تشريح صغيرةF.S.T.14060-10
وسط MEM EagleCellgro50-019 PB
مصل خيول مثبط حرارياًInvitrogen26050-88
L-Glutamine (200 mM)Invitrogen25030081
CaCl2 (1 M)Sigma-AldrichC3881
MgSO4 (1 M)Sigma-AldrichM2773
إنسولين (1 mg/ml)، مذاب في HCl 0.01 NSigma-AldrichI0516
حمض الأسكوربيك، محلول (25%)Sigma-AldrichA4544
D-GlucoseSigma-AldrichG5767
NaHCO3Sigma-AldrichS6014
HepesSigma-AldrichH7523
سكروزSigma-AldrichS5016
محلول أحمر الفينول 0.5% في DPBSSigma-AldrichP0290
KClSigma-AldrichP3911
MgCl2 (1 M)Sigma-AldrichM9272

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
  2. Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
  3. Shepherd, G. M. The synaptic organization of the brain. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).
  4. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  5. Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  6. Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
  7. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
  8. Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
  9. Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
  10. Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
  11. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  12. Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة