تنشأ أورام المثانة في إناث الفئران بطريقة مينيملي من خلال قسطرة ، الكي المحلية ، والتصاق الخلايا السرطانية لاحقا الى مواقع الحرق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذا الإجراء واضحة ، وضعت أورام المثانة لدى الفئران الإناث C57 عن طريق استخدام قسطرة ، الكي المحلية ، وبعد التصاق الخلية. بعد مقسطر transurethrally قربة وتصريفها ، ومرة أخرى مقسطر الحيوانات للسماح بإدخال سلك البلاتين في قربة دون الإضرار مجرى البول أو المثانة. يتم إجراء القسطرة من التفلون لتكون بمثابة عازل عن السلك ، والتي سوف تجري التيار الكهربائي في المثانة لإنشاء إصابات الحروق. وتستخدم وحدة كاو كهربي لتسليم 2.5W إلى نهاية المكشوفة من الأسلاك ، وحرق بعيدا طبقات خارج الخلية ، وتوفير مواقع للخلايا سرطان مرفق التي يتم تسليمها في تعليق إلى المثانة عن طريق القسطرة لاحقة. الخلايا تبقى في المثانة لمدة 90 دقيقة ، وبعد ذلك تتم إزالة القسطرة وقربة يسمح لاستنزاف طبيعي. ويتم رصد تطور الورم عن طريق الموجات فوق الصوتية. ويولى اهتمام محدد لتقنية القسطرة في شريط الفيديو المرافق له.
البروتوكول
1. الحيوانات
- يتم التحقق من الإناث C57BL/6J الفئران (المصحف العضلة) خالية من الطفيليات الخارجية المعدية ، endoparasites الديدان الطفيلية ، والأجسام المضادة للفيروسات 17 الفئران من قبل البائع قبل الشحن. إيواء الفئران في منشأة الحيوان AAALAC المعتمدة من جامعة تولين وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات في المختبر. 1
- على وجه التحديد ، والفئران ويضم مجموعة (4-5 الفئران / القفص) في تهوية منفردة قمم البولي microisolation cageswith تصفية على الفراش الصلبة. تقدم لهم الطعام بالمال وبالشهرة أيضا الإعلان القوارض ومكعبات مياه الحنفية.
- ويسمح للفئران 7 أيام للتأقلم قبل بدء الدراسة.
2. الخلايا
- يتم استخدام الفئران سرطان الخلايا الانتقالية MB49 خط الخلية لإنتاج أورام المثانة.
- يتم تربيتها في الخلايا المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ ، 100 وحدة / مل البنسلين ، ووحدات / 100 مل الستربتوميسين.
- تتم المحافظة على الثقافات عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 مع وسائل الاعلام يتغير كل يومين أو ثلاثة أيام.
3. نموذج حيواني ورم مثلي
وتقطير المثانة ورم نموذج الموصوفة هنا هو تعديل للإجراءات التي وصفها آخرون غونتر 2
- وبفعل التخدير مع 2 ٪ isoflurane (MWI / VetOne ، ميريديان ، ID ، القط # 501017) في الأوكسجين والحفاظ على 0،75-1،25 ٪. (ويمكن علاج الحيوانات متعددة في وقت واحد ، الأمر الذي يتطلب زيادة في مستويات isoflurane) لمنع جفاف القرنية ، ومشحم مع مرهم عيون اصطناعية العيون بالدموع. المحافظة على حرارة الجسم مع وسادة ساخنة تحت ثنى الورق.
- يتم قص الفراء من أسفل الظهر لتعزيز الاتصال مع صفيحة معدنية التأريض ، والمغلفة منطقة حلق مع هلام electroconduction.
- ومن ثم وضعت كل على حدة في الماوس recumbancy الظهرية على لوحة معدنية التأريض ، ومقسطر المثانة باستخدام transurethrally a مشحم قياس 24 ، 3 / 4 بوصة ، والقسطرة رابعا الافراط في إبرة مع مرود إزالتها.
- يتم تصريف البول من المثانة البول ، ويتم إدخال سلك البلاتين عن طريق قسطرة في المثانة البولية ترك سلك تعرض على كل طرف من القسطرة -- 2 مم تقريبا على نهاية lumenal من القسطرة. يتكون سلك من البلاتين بسبب المقاومة للمواد للأكسدة.
- ثم يتم تطبيق تيار W 2.5 إلى المثانة لحوالي 0.5 ثانية عن طريق لمس الجزء الخارجي من الأسلاك مع وحدة كاو كهربي لتعيين التخثر.
- ومن ثم انتقل إلى السلك الموقع الثاني في المثانة وتهمة اخرى W 2.5 التطبيقية.
- إزالة الأسلاك ، و 100 ميكرولتر من MB49 الخلايا في تركيز خلايا 1x10 6 / مل وتغرس من خلال قسطرة في المثانة عن طريق حقنة 1ml.
- يتم ترك المحاقن التي تعلق على القسطرة لمنع هروب رأس المال من الايقاف الخلية ، ويتم الحفاظ على الفئران مقسطر تحت التخدير لمدة 90 دقيقة للسماح للخلايا لتعلقها على مواقع الحرق.
- يدار 100-200 ميكرولتر من المياه المالحة عن طريق الحقن المعقمة العادية IP لكل الماوس قبل الانتعاش.
- في نهاية فترة الحضانة يتم إزالة القسطرة وغير مسموح للحيوانات لاسترداد على لوحة ساخنة حتى تصحيح ردود الفعل المقابل ، وعند هذه النقطة يتم إرجاع الفئران لأقفاص وطنهم.
4. الموجات فوق الصوتية
- ويسمح للنمو الأورام لمدة 3-5 أيام قبل الفحص بالموجات فوق الصوتية الفئران من المثانة البولية لمراقبة نمو الورم.
- الموجات فوق الصوتية لفحص الأولي ، يتم تخدير الحيوانات كما هو موضح أعلاه. يتم وضع الفئران في recumbancy الظهرية ، وهي على استعداد لقطة جلد البطن بواسطة الفراء.
- يتم إدخال القسطرة رابعا قياس 24 transurethrally في المثانة البولية. عند هذه النقطة ، يمكن أن ينضب المثانة والبول التي جمعت لمزيد من التحليل.
- وتغرس 100 ميكرولتر من الطبيعي المالحة عقيمة في المثانة عن طريق القسطرة لتحسين الرؤية على المثانة بالموجات فوق الصوتية.
- يتم تطبيق الموجات فوق الصوتية هلام التوصيل في البطن ، ويتم تنفيذ التصوير بالموجات فوق الصوتية لتقييم جدار المثانة والتجويف.
5. ممثل النتائج :
سوف الأنسجة السرطانية تبدأ في الظهور بعد 3-5 أيام innoculation. في تجربتنا ، في مجموعة من الفئران 12 ، 50 ٪ أو أكثر بشكل روتيني لديك كتلة النسيج للكشف داخل المثانة (0،5-1،0 ميكرولتر ، وذلك باستخدام V = π / 6 · ° W L * ح) من قبل خمسة أيام. عند استخدام 49 ميغابايت خلايا الأورام سوف تستمر في النمو ، وسوف يكون مطلوبا من قبل يوم 24 القتل الرحيم إذا كانت الفئران تذهب دون علاج. ينصح القتل الرحيم عندما تصبح الفئران السبات العميق أو مدنف ، وعرض الفراء تكدرت ، hunching ، والسلوك غير متجاوبة ، أو عندما يفقد 20 ٪ من وزن الجسم الأولية
الأورام تنمو بسرعة وسيكون لها مراكز نخرية بعد وصولها إلى كتلة من 200 ملغ أو أكثر ، 3 ظاهريا لأن الخلايا في الورم تتكاثر بمعدل أسرع من تطوير ما يمكن أن تخدمها إمدادات الدم عائية. يمكن للمرء أيضا أن ترصد بشكل غير مباشر عن طريق تطور الورم على مستوى hematurea ، والتي يفترض أن يرتبط السريع الأوعية الدموية داخل الأورام النامية. وقد لوحظ باستمرار أن البول من الفئران الحاملة للورم غير المعالجة الواردة في الدم عن طريق 14 يوما. وبدا تركيز خلايا الدم الحمراء لزيادة مع مرور الوقت في هذه الفئران ، وكميات من البول التي جمعت في تضاؤل مستمر. ويمكن أيضا الأورام في أكثر من 50 ملغ من متلمس بسهولة نسبية ، وعادة بنسبة 14 innoculation آخر أيام.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كما يمكن هذا الأسلوب مينيملي إنشاء أورام المثانة مثلي في إناث الفئران يمكن تطبيقها لأنواع الخلايا الأخرى من MB49 ، وإن كان ينبغي توقع نتائج مختلفة. عندما تستخدم الخلايا السرطانية أقل عدوانية ، وزيادة القوة الكهربائية قليلا (0.5 باستخدام زيادات W الأمثل لتأسيس جديد) العائد على مساحة أكثر استعدادا للمرفق الخلية السرطانية ، وأوقات أطول حضانة للخلايا المثانة غرست سيحقق قدرا أكبر من مرفق خلية في مواقع حرق (بيانات غير منشورة). وينبغي على الرغم من بعض البروتوكولات يوصي بتوفير 10 واط عبر ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها لجنة رعاية المؤسسية واستخدم في جامعة تولين.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل على جائزة مؤسسة العلوم الوطنية التوظيف (CBET - 0846395) ، وقسم الطب المقارن ، جامعة تولين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| فئران C57Bl/6J | Jackson Laboratory | 000664 | عمرها 3-5 أسابيع |
| أقفاص بولي كربونات ورف تهوية | Lab Products | Super Mouse 750 | 327mm x 190mm x 143mm |
| فرشة من الخشب الصلب | Harlan Laboratories | SaniChips من الدرجة المختبرية – | |
| غذاء القوارض | Harlan Laboratories | Rodent Diet 2019 | |
| قسطرة وريدية | MWI Veterinary Supply | 009231 | 24 G x ¾ in. |
| وحدة كي كهربائي | Bovie Medical Corporation | Aaron 900 | |
| وحدة موجات فوق صوتية | Sonosite | 180 Plus (Vet) | |
| خط خلايا MB49 | Wake Forest University Baptist Medical Center | غير متاح | |
| وسط DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| مصل جنين البقر | Gemini Bio Products | 100106 500A57B | |
| بنسلين-ستربتومايسين | Invitrogen | 15140-163 |
المراجع
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma. Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
