توضح هذه المقالة تقنية زرع الانسجة التي تم تصميمها لاختبار الإشارات وخصائص الزخرفة من الأديم الظاهر سطح الرأس أثناء تطوير القحفي.
مقالة منهجية
تقييم خصائص اشارة من الظهارة الأدمة خلال التنمية الجمجمة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد ساعدت سهولة الحصول على أجنة الطيور علم الجنين التجريبي فهم مصائر الخلايا أثناء التطور ودور الأنسجة التي تنظم التفاعلات الزخرفة والتشكل من الفقاريات (على سبيل المثال ، 1 ، 2 ، 3 ، 4). هنا ، نحن لتوضيح أسلوب الذي يستغل هذا الوصول لاختبار الإشارات وخصائص الزخرفة الأدمة من أنسجة الوجه أثناء تطوير. في هذه التجارب ، فإننا نخلق السمان ، فرخ 5 أو الماوس الفرخ 6 من زرع الوهم في الأديم الظاهر السطحي الذي يغطي الرأس والفك العلوي من السمان أو الماوس على المنطقة إما نفسه أو في منطقة خارج الرحم لافراخ الدجاج. وقد تم تطوير استخدام السمان والأنسجة المانحة للزرع في الدجاج للاستفادة من علامة موجودة في نويي السمان ولكن الخلايا لا الفرخ ، وبالتالي السماح للمحققين تميز المضيفة والمانحة الأنسجة 7. وبالمثل ، وهو عنصر المتكررة موجودة في جينوم الفأر ، ويعبر بتواجد مطلق ، والذي يسمح لنا أن نميز بين المضيفة والمانحة في الأنسجة الفرخ الفأر الوهم 8. سيتم استخدام الماوس كما الأديم الظاهر تمديد الأنسجة المانحة إلى حد كبير فهمنا لهذه التفاعلات الأنسجة ، وذلك لأن هذا سوف يسمح لنا لاختبار خصائص الإشارات من الأديم الظاهر المستمدة من أجنة متحولة مختلفة.
البروتوكول
1. إعداد الأنسجة المانحة
- تعد وسائل الإعلام والثقافة ، وصقل الزجاج الدبابيس ، وشحذ الإبر التنغستن.
- جمع الجنين من قذيفة ، ويغسل في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
- باستخدام الحقنة 10 مل و إبرة قياس 18 مل من 1.0 إزالة الزلال من نهاية وأشار من قشرة البيضة.
- جعل ثقب صغير في الجزء العلوي من الغلاف باستخدام مقص نقطة ، وقطع دائرية ثم فتح للكشف عن الجنين
- إزالة الرأس والمكان الى DMEM (المصل الحرة ، ودرجة حرارة الغرفة)
- عملية تشريح الجبهية من الجنين (أو غيرها من الجهات المانحة مثل موقع عملية الفك العلوي أو الفك السفلي)
- في هضم 2.4U / مل dispase في برنامج تلفزيوني على الجليد ل20mins
- تغطية الأنسجة مع DMEM مع جيش صرب البوسنة 1 ٪ لوقف عملية الهضم
- استخدام الإبر التنغستن شحذ إلى الأديم الظاهر منفصلة ، اللحمة المتوسطة ، وneuroectoderm
- تخزين الأنسجة الكسب غير المشروع في جيش صرب البوسنة DMEM 1 ٪ على الجليد حتى المضيفة مستعدة للزرع
2. إعداد المضيف
- تعرض الجنين
- باستخدام الحقنة 10 مل و إبرة قياس 18 مل من 1.0 إزالة الزلال من نهاية وأشار من قشرة البيضة.
- جعل ثقب صغير في الجزء العلوي من الغلاف باستخدام مقص نقطة. ضع قطعة من الشريط فوق الحفرة ، وقطع دائرية ثم فتح للكشف عن الجنين.
- 2 به زوجا من الملقط ، فهم السلى وبلطف المسيل للدموع لإحداث الثقب.
- استدارة الرأس بوضع زوج من ملقط على العين اليمنى والضغط. في حين عقد رئيس مطرد ، واستخدام إبرة لإزالة التنغستن الأديم الظاهر المضيف لاستيعاب الكسب غير المشروع.
- نقل الكسب غير المشروع إلى المضيف باستخدام ماصة الزجاج.
- موقف الكسب غير المشروع لتحل محل الأديم الظاهر إزالتها. اضافة الى وجود دبوس الزجاج في كل زاوية من النسيج المطعمة يعلقون الكسب غير المشروع في المكان. دبابيس لجعل الزجاج ، وسحب أنبوب microcapillary إلى نقطة غرامة على مدى اللهب الكحول.
- مكان الشريط بإحكام خلال ثقب والعودة الجنين الى حاضنة لمدة مناسبة من الوقت لتحليلها.
- انظر أيضا : 9
3. ممثل النتائج :
لتقييم الوهم ، ينبغي جمع الأجنة ومعالجتها لتحليل توزيع المضيفة والمانحة الأنسجة. للكشف عن خلايا السمان ، المناعية باستخدام أجسام مضادة QcPN (الموصوفة في : 3) يعمل ، وللكشف عن خلايا فأر في التهجين الموقع على أقسام البارافين يستخدم 6. وينبغي أن يقتصر الخلايا المانحة للظهارة ، وينبغي أن يكون هناك أي دليل على أنسجة المانحة الوسيطة (الشكل 1). وجود خلايا المانحة المعزولة في اللحمة المتوسطة يدل على وجود الخلايا العصبية التي تلوث قمة سوف نخلط أي تفسير الشكلية نظرا لتأثير هذه الخلايا على العديد من جوانب التنمية الوجه (على سبيل المثال ، 10). مرة واحدة على اقتناع بأن تقنية خالية من الكسب غير المشروع هو تلويث اللحمة المتوسطة ، ويمكن استخدام مزيد من التدابير نتائج المورفولوجية أو الجزيئي لتقييم الوهم. لأغراضنا ، اكتشفنا وجود حمل خارج الرحم الغضاريف والعظام التي تتوافق مع الازدواجية في الفك العلوي التي يسببها الأنسجة المزروعة (الشكل 2) ، والتغيرات الجزيئية في الأنسجة الوسيطة ردا على المطعمة الأديم الظاهر (الشكل 3) 5،6.
الشكل 1. تقييم الخيمرية يستخدم (أ) مكافحة QcPN تلوين للكشف عن خلايا في السمان السمان ، فرخ الوهم. لا يوجد أي دليل على تلطيخ في اللحمة المتوسطة. يستخدم (B) في الموقع التهجين للكشف عن التعبير النصوص B2 شرط في الماوس الفرخ الوهم. ويقتصر التعبير على الأديم الظاهر تضم الكسب غير المشروع.
الشكل 2. تلوين ثلاثي الألوان يظهر ازدواجية هيكل عظمي الفك العلوي في خيمر السمان ، الفرخ (A) و (B) الوهم الماوس الفرخ.
الشكل 3 ، والأديم الظاهر regultes التعبير الجيني في اللحمة المتوسطة. (أ) عادي Bmp7 التعبير في اللحمة المتوسطة من جنين الفرخ (المشعة في الموقع التهجين مع الإيجابية الزائفة أحمر اللون في إشارة أدوبي فوتوشوب). (ب) هي التي يسببها Bmp7 التعبير في اللحمة المتوسطة المتاخمة للطعم (السهم) في أجنة خيالية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
باستخدام هذا الأسلوب زرع سمح لنا لتحديد الأديم الظاهر أن يحتوي على معلومات يشير إلى أن ينظم قطبية ظهري بطني والإرشاد proximodistal من الفك العلوي. التشابه في النتائج عند استخدام الماوس السمان أو الأديم الظاهر ، والحفاظ على الاشارات الجزيئية في هذا النسيج من بين العديد من الأنواع 6،11 يشير إلى أن هذا هو مركز للغاية الحفظ إشارات بين الفقاريات. وعلاوة على ذلك ، استخدمت محققين آخرين تقنيات مشابهة لاختبار خصائص إشارات من مناطق مختلفة من الأديم الظاهر سطح رأسي وكشفت وجود العد...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل DE018234 - R01 R01 وDE019638.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| محلول منظم من الفوسفات الملحي بتركيز 1x (1x PBS) | Tektronix, Inc. | TEKZR114 | |
| وسط DMEM | جامعة كاليفورنيا - سان فرانسيسكو | CCFDA003 | |
| ألبومين المصل البقري (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| ديسبيز (Dispase) | GIBCO، من شركة Life Technologies | 17105-041 | |
| طبق بتري بمقاس 35×10 مم | Falcon BD | 1008 | |
| ملقط Dumont رقم 5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| مقص | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| مقصات نابضية | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| حامل إبرة | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| إبرة تنغستن | Fine Science Tools | 26000 | |
| أنبوب شعري دقيق | Drummond Scientific | 3-000-225-G | |
| ماصات باستور | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| مقصات زنبركية | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| حامل الشفرة | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| شفرة حلاقة | Fine Science Tools | 10050-00 |
المراجع
- Noden, D. M. The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues. Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).
- Bronner-Fraser, M., Stern, C. Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration. Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).
- Schneider, R. A. Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton. Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).
- Couly, G. Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head. Development. 129, 1061-1061 (2002).
- Evans, D. J., Noden, D. M. Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells. Dev Dyn. , (2006).
- Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130, 1749-1749 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Dev Biol. 325, 200-200 (2009).
- Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).
- Bollag, R. J. Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras. Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development. Development. 132, 1499-1499 (2005).
- Odent, S. Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly. Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).
- Szabo-Rogers, H. L. Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit. Development. 136, 219-219 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن