يوصف استخدام نظم microvolume NanoDrop كبدائل عملية وفعالة للحمض النووي التقليدية من خلال منهجية الكميات المظاهرة اثنين من بروتوكولات الكميات microvolume النووية الحمضية.
مقالة منهجية
NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويجري باستمرار المقايسات الجزيئية البيولوجية المتقدمة التي تستخدم كميات صغيرة من المواد تدريجيا ، غالبا ما يحول دون استخدام الأدوات التقليدية المستندة كفيت عن الكميات الحمض النووي لتلك التي يمكن أن تؤدي الكميات microvolume.
العينة microvolume NanoDrop نظام الاستبقاء (المنتجات الحرارية NanoDrop العلمية) من خلال الجمع بين وظائف تكنولوجيا الألياف البصرية ، والخصائص الطبيعية التوتر السطحي لالتقاط والاحتفاظ بها كميات ضئيلة من عينة مستقلة عن أجهزة الاحتواء التقليدية مثل cuvettes أو الشعيرات الدموية. وعلاوة على ذلك ، فإن النظام يعمل طول مسار أقصر ، مما يؤدي إلى طائفة واسعة من قياسات تركيز حمض النووي ، والقضاء اساسا على الحاجة إلى إجراء التخفيفات. تخفيض حجم العينة المطلوبة لتحليل الطيفي تسهل أيضا إدراج خطوات إضافية لمراقبة الجودة في جميع أنحاء سير العمل الجزيئية كثيرة ، وزيادة كفاءة ويؤدي في نهاية المطاف إلى مزيد من الثقة في النتائج النهائية.
وقد برزت الحاجة إلى حساسية عالية من التحليل الشامل الفلورسنت محدودة أيضا مع التقدم التجريبية الاخيرة. باستخدام التكنولوجيا نفسها microvolume الاحتفاظ عينة ، قد يتم تنفيذ قياسات الفلورسنت مع 2 ميكرولتر من المواد ، مما يسمح الفلورسنت متطلبات حجم المقايسات خفضت بشكل ملحوظ. microreactions هذه ميكرولتر من 10 أو أقل من الممكن الآن استخدام fluorospectrometer microvolume مخصص.
سيظهر اثنين microvolume الكميات الحمض النووي البروتوكولات التي تستخدم نظم متكاملة الاحتفاظ العينة كما بدائل عملية لبروتوكولات كفيت التقليدية القائمة. الأول ، هو وصف لطريقة مباشرة الامتصاصية A260 باستخدام معمل microvolume. اعقب ذلك عرض لطريقة مضان على أساس أنه يتيح تقليص حجم وتفاعلات مع مضان fluorospectrometer microvolume. هذه التقنيات الجديدة تمكن من تقييم تركيز الحمض النووي التي تتراوح بين 1 بيكوغرام / ميكرولتر إلى 15000 نانوغرام / ميكرولتر مع استهلاك الحد الأدنى من العينة.
البروتوكول
1. Microvolume الكمي الأحماض النووية باستخدام 2000c NanoDrop الطيف
- لتبدأ ، وتنظيف الأسطح العلوية والسفلية البصري للنظام معمل microvolume الاحتفاظ العينة pipetting 2-3 ميكرولتر من المياه النظيفة منزوع الأيونات على سطح الدنيا البصرية.
- إغلاق ذراع الرافعة ، وضمان أن رمى العليا يأتي في اتصال مع الماء منزوع الأيونات. رفع ذراع الرافعة وتمحو كل من السطوح البصرية مع نظيفة ، خالية من الوبر ، جافة محو المختبر.
- افتح البرنامج وحدد NanoDrop تطبيق الأحماض النووية. استخدام صغيرة الحجم ، pipettor معايرة لإجراء القياس بواسطة فارغة الاستغناء 1 ميكرولتر من عازلة على السطح السفلي البصرية. انخفاض ذراع الرافعة وحدد "فارغة" في تطبيق الأحماض النووية.
- بمجرد اكتمال قياس فارغة ونظيفة والسطوح البصرية على حد سواء مع نظيفة ، خالية من الوبر ، جافة محو المختبر.
- اختر ثابتة ملائمة للعينة التي سيتم قياسها.
الجدول 1. النموذجية تركيز حمض النووي نطاقات مباشرة قياسات الامتصاصية A280 باستخدام NanoDrop microvolume معمل ، وكفيت التقليدية المستندة إلى معمل استخدامها مع كفيت microcell TrayCell ، وfluorospectrometer NanoDrop microvolume بالتزامن مع مقايسة PicoGreen.نوع العينة حدد الخيار ثابت يستخدم لحساب التركيز dsDNA DNA - 50 50 ssDNA DNA - 33 33 RNA RNA - 40 40 أليغو عرف 15-150 - الاستغناء 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي على قاعدة التمثال انخفاض البصرية وإغلاق ذراع الرافعة. لأن القياس هو حجم مستقلة ، والعينة يحتاج فقط إلى سد الفجوة بين سطحين البصرية للقياس في هذا الشأن.
- حدد "القياس" في تطبيق البرمجيات. يقوم البرنامج تلقائيا بحساب تركيز حمض النووي ونقاء النسب. قياس العينة التالية ، استعراض الإخراج الطيفية.
- يقوم البرنامج تلقائيا بحساب تركيز حمض النووي ونقاء النسب. قياس العينة التالية ، واستعراض الصور الطيفية لتقييم جودة عينة.
- وهناك عينة نموذجية من الحمض النووي لمحة مميزة جدا.
الشكل 1. سوف نموذجي عينة الحمض النووي لديك ملف مميزة جدا. - مصادر مشتركة من الملوثات المرتبطة محددة تقنيات عزل الحمض النووي تشمل استخراج الفينول / Trizol والعمود. في حالة استخراج الفينول / Trizol ، قد أشارت المتبقية التلوث بواسطة كاشف أطياف شاذة بين 220-240 نانومتر فضلا عن التحولات في المنطقة 260-280 نانومتر. على العكس ، قد الجوانيدين المتبقية من استخراج العمود تسهم في ذروة قرب 230 نانومتر ، وتحولا في الحوض الصغير من 230 نانومتر إلى حوالي 240 نانومتر.
الشكل 2 ، والتحولات في القمم وهبوطا من B و C العينات بالمقارنة مع عينة لتوضيح كيفية الملوثات يمكن أن تؤثر على أطياف عينات الحمض النووي. - لتقييم جودة عينة من الدقة ، ينبغي تحليل 260/280 260/230 أو نسب في تركيبة مع الجودة الشاملة الطيفية. الأحماض النووية محض عادة نسبة العائد 260/280 من ~ 1.8 و 260/280 من نسبة 2.0 ~ ل DNA و RNA ، على التوالي. هذه النسبة تعتمد على درجة الحموضة والقوة الأيونية للالعازلة التي استخدمت لصنع نموذج فارغ والقياسات. والمحاليل الحمضية تحت تمثل النسبة التي 0،2-0،3 ، في حين أن الحل الأساسي والإفراط في تمثيل النسبة التي 0،2-0،3. قد تختلف اختلافا كبيرا نقاء النسب تشير إلى وجود الملوثات ، والفينول أو غيرها من البروتين التي تمتص بشدة عند أو بالقرب من 280 نانومتر. نسبة نقاوة 260/230 هو التدبير الثاني من النقاء الحمض النووي مع القيم عن "نقية" الحمض النووي عادة في نطاق 1،8-2،2. وقد نسب نقاء التي هي أقل بكثير من القيم المتوقعة تشير إلى استخدام أسلوب العزل قد تتطلب التحسين أخرى.
- ويمكن أيضا أن تستخدم NanoDrop مطياف لقياس بروتينات باستخدام الامتصاصية المباشر أو عن طريق فحوصات بروتين اللونية. المناسبة لضمان تشكيل العمود واستنساخ ، وينصح 2 ميكرولتر العينات للحصول على عينات من البروتين. الرجوع إلى الفيديو إن الرب التالية : Microvolume تحديد تركيز البروتين استخدام الطيف NanoDrop https://www.jove.com/index/Details.stp؟ID=1610
ق = "jove_title"> 2. عالية الحساسية Microvolume الكميات الأحماض النووية باستخدام NanoDrop 3300 Fluorospectrometer
- لإثبات ذات حساسية عالية microvolume الكميات باستخدام الحمض النووي NanoDrop 3300 ، تم استخدام عدة PicoGreen مضان. لتبدأ ، يوازن معايير عدة ، وجميع عينات الحمض النووي إلى درجة حرارة الغرفة. عينات الفلورسنت خفيفة حساسة ويجب أن يوضع في العنبر أو أنابيب مغلفة الألومنيوم.
- إعداد 1X يكفي TE العازلة للجميع المعايير والعينات المراد قياسها وكذلك من أجل حل PicoGreen العمل التي ستكون هناك حاجة. إعداد 1xTE العازلة التي قدمت تمييع 20X TE العازلة مع nuclease خالية من المياه في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. رد فعل يمكن أن أحجام تتراوح ما بين 200 ميكرولتر إلى أقل من 10 ماي. في هذا المثال ، سيتم إعداد 10 مجلدات رد فعل ميكرولتر.
- إعداد معايير dsDNA متسلسل المخفف في التركيز النهائي المطلوب في 2X nuclease خالية من قوارير أو أنابيب. نقل 5 ميكرولتر من كل من معايير dsDNA المخفف في الفرد المسمى nuclease خالية من العنبر أو احباط المغطاة الأنبوب.
- قسامة 5 ميكرولتر من كل عينة من dsDNA الفائدة في العنبر nuclease خالية المسمى بشكل مناسب أو احباط المغطاة الأنابيب.
- يعد حل PicoGreen العمل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. نقل حجم مساو من الحل PicoGreen العمل على كل أنبوب تحتوي إما القياسية أو عينة من الفائدة (5 ميكرولتر في هذا المثال).
- تجمع كميات متساوية من 1X TE العازلة وPicoGreen حل عمل للاعداد لسيطرة السلبية ، التي هي بمثابة حل المرجع.
- خلط محتويات كل أنبوب دقيق من قبل pipetting رد فعل لطيف واحتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ينبغي لجميع المعايير ومعايرتها العينات إلى نفس درجة الحرارة قبل القياس كما يتأثر بدرجة الحرارة إشارة مضان.
- لإعداد وتنفيذ صك القياسات ، وتنظيف الأسطح أولا السفلي والعلوي من العينة نظام الاستبقاء. الماصة 2-3 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات على السطح السفلي الضوئية ، ثم أغلق فتح ذراع الرافعة ، وصمة عار على الركائز العليا والسفلى مع نظيفة ، خالية من الوبر ، والمختبرات القضاء. ضمان الأسطح خالية من الوبر قبل المضي قدما كما يمكن أن يحمل مضان الوبر في وجود مصدر الإثارة ويمكن أن تتداخل مع القياس.
- فتح أداة البرمجيات ، حدد "الأحماض النووية" التطبيق ، وحدد "PicoGreen - dsDNA" الخيار.
- إلى فارغة الصك ، إضافة 2 ميكرولتر من TE 1X إلى انخفاض رمى ، على مقربة من الذراع ، وحدد "فارغة" في الصك مجال البرمجيات. بمجرد اكتمال فارغة ، وصمة عار قبالة حل فارغة من كل السطوح من العينة نظام الاستبقاء.
- مزيج الحل إشارة pipetting لطيف. نصائح الاحتفاظ به منخفضة ، ماصة 2 ميكرولتر على أقل رمى وإغلاق الذراع.
- حدد "مرجع" في نوع القياس ، وحدد الوحدات المطلوبة. انقر على "التدبير" لبدء دورة القياس.
- عندما تكون دورة القياس اكتمال فتح الذراع وصمة عار تماما قبالة السطوح عينة نظام الاستبقاء. قياس ما يصل إلى خمسة مكررات الإشارة ، وذلك باستخدام قسامة جديدة لكل تكرار.
- كرر العملية لمعايير إضافية لبناء منحنى القياسية. ويمكن استخدام ما يصل الى سبعة المعايير. وقد صمم البرنامج لتخزين ما يصل إلى خمسة مكررات لكل معيار. وبلغ متوسط مكررات من المعايير لإنشاء منحنى القياسية التي تتحدد تلقائيا تركيزات العينة.
- بمجرد اكتمال منحنى القياسية ، حدد "عينات" التبويب ، أدخل الرقم عينة منها المعلومات وقياس كل عينة مجهولة.
المناقشة
تستند بروتوكولات الكميات المعروضة هنا على أنظمة microvolume الأكثر قبولا على نطاق واسع. مثل هذه الأنظمة توفير بدائل عملية للحمض النووي المنهجية التقليدية الكميات ، التي تعتمد على كميات أكبر من العينات واستخدام أجهزة الاحتواء.
NanoDrop microvolume توظف التكنولوجيا نظام الاحتفاظ العينة التي تعتمد على خصائص التوتر السطحي من العينة التي يجري قياسها على شكل عمود السائل. فمن الضروري أن العينة يجعل الاتصال مع قياس السطوح البصرية العلوي والسفلي لتشكيل العمود المناسب. إذا في أي نقطة من نتائج القياس يبدو غير صحيحة أو لا يمكن استنساخه ، فمن الأرجح نتيجة عدم التجانس أو عينة السائل كسر العمود.
لا ينصح المنظفات ومواد التنظيف ايزوبروبيل لأنها قد uncondition السطوح قياس التمثال. ورمى دون شروط يحدث عندما تعرضت لما يثير الشبهة خصائص سطح مسعور من التمثال ، مما أدى إلى تسطيح للقطيرة عينة. ويمكن أن يؤدي إلى الركائز دون شروط كسر العمود السائل خلال القياس.
ويتميز الشكل 3. السطح دون شروط من قبل تسطيح قطرات المياه.
قد تكون مجددة السطوح رمى به Uncondtioned NanoDrop مجمع الركيزة تجديد (PR - 1 ، الحرارية العلمية منتجات NanoDrop). يتم تطبيق طبقة رقيقة من مجمع مساحته إلى السطوح رمى العلوي والسفلي ، سمح لتجف لمدة 30 ثانية ~ ، ثم يفرك قبالة باستخدام جافة ونظيفة وخالية من الوبر مختبر المسح. وتتميز حالة مجددة بنجاح بواسطة قطرات المياه الديكور حتى عندما يطبق إلى أسفل سطح التمثال.
الشكل 4. يتميز سطح مجددة من الديكور تتكون من قطرات الماء.
نظم الكميات Microvolume الحد بشكل كبير من استهلاك العينة وزيادة كبيرة في نطاق التركيز عند مقارنة لأنظمة القياس الكمي أكثر تقليدية. على الرغم من أن الكميات microvolume أصبحت في كثير من الأحيان عبارة عن تقنية تمكن من الظروف التي تنطوي على محدودية كتلة الخلية مثل إبرة الخزعات وmicrodissection الليزر التقاط والكفاءة وسهولة استخدام هذه المنهجية قد جعل من بديل لقبول التقليدية على نطاق واسع الكميات حمض النووي حتى طرق عندما عينة وفيرة.
الإفصاحات
ويعمل فيليب ديجاردان وكونكلين ديبرا المنتجات الحرارية التي NanoDrop العلمية ، وشركة التي تنتج الأدوات المستخدمة في هذه المقالة.
شكر وتقدير
ريتشارد دبليو برنجر وديفيد آش L. ، تطبيقات العلماء ، والمنتجات الحرارية NanoDrop العلمية ، للحصول على المساعدة الفنية والتصوير.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| NanoDrop 2000c | شركة تيرمو فيشر ساينتيفيك (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | ND-2000C | |
| NanoDrop 3300 | شركة تيرمو فيشر ساينتيفيك (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | ND-3300 |
المراجع
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques. 22, 474-481 (1997).
- Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. Implen Applications Note. , Munich, Germany. (2006).
- Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. Spectrochemical analysis. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).
- Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA. Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن