Method Article

الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA

DOI:

10.3791/2593

⸱

April 26th, 2011

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University , 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University of Connecticut

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النيوكليوسوم ELISA (NU-ELISA) هي طريقة حساسة وكمية للكشف عن الأنماط العالمية لتعديلات ما بعد الترجمة في مستحضرات النيوكليوسومات الأصلية السليمة. تشمل هذه التعديلات المثيلة ، والأستيلات ، والفسفرة في بقايا أحماض هيستون أمينية معينة ، وبالتالي توفر NU-ELISA فحصا بروتينيا عالميا لحالات تعديل الكروماتين الإجمالية لأنواع معينة من الخلايا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content">يوجد جينوم حقيقيات النوى على شكل كروماتين يحتوي على كل من الحمض النووي والبروتينات. الوحدة الأساسية للكروماتين هي النيوكليوسوم ، الذي يحتوي على 146 زوجا أساسيا من الحمض النووي مرتبطا بزوجين من كل من الهستونات H2A و H2B و H3 و H41. ذيول المحطة N للهيستونات غنية بالليسين والأرجينين ويتم تعديلها بعد النسخ عن طريق الأستلة والمثيلة وغيرها من التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs). يمكن أن يؤثر تكوين PTM للنيوكليوسومات على نشاط النسخ للحمض النووي المرتبط ، وبالتالي توفير طريقة لتنظيم الجينات ذات الطبيعة اللاجينية 2،3. قمنا بتطوير طريقة تسمى النيوكليوسوم ELISA (NU-ELISA) لتحديد توقيعات PTM العالمية للنيوكليوسومات المستخرجة من الخلايا كميا. يعتبر NU-ELISA أكثر حساسية وكمية من النشاف الغربي ، وهو مفيد في استجواب الحالة اللبومية لأنواع معينة من الخلايا. تعرض مقالة مجلة الفيديو هذه إجراءات مفصلة لإجراء تحليل NU-ELISA.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_title" >1. زراعة خلايا الثدييات

يمكن إجراء

NU-ELISA على أي نوع من خلايا الثدييات التي يمكن زراعتها في المزرعة. نفضل تحضير دفعات متوسطة إلى كبيرة من الخلايا بحيث يمكن عزل النيوكليوسومات بكميات كافية لإعداد العديد من ألواح ELISA المحملة بشكل متماثل ، مما يسمح بإجراء فحوصات مع العديد من الأجسام المضادة المختلفة (Abs). توفر مقاييس الثقافة التالية مواد وافرة:

بالنسبة للخلايا الجذعية الصنمية للفأر ، قم بزراعة صفيحة أو صفيحتين من الخلايا مقاس 15 سم بدون خلايا مغذية. بالنسبة للأرومات الليفية ، تنمو من 5 إلى 10 ألواح 15 سم حتى التقاء.

< p class = "jove_title" >2. عزل النوى

ملاحظة: جميع الخطوات على الجليد مع مخازن مبردة مسبقا ، باستثناء ما هو موضح.

  1. قم بعمل التربسين مع 3 مل من التربسين لكل طبق ، وامزجها وأضف 20 مل من PBS / الزبدات المثلجة. جهاز طرد مركزي عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  2. أعد تعليق الخلايا في 10 مل PBS / الزبدات وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  3. يعاد تعليقه في مخزن مؤقت للتحلل سعة 4 مل مع مثبطات الإنزيم البروتيني (Sigma-Aldrich P-8340). قم بتجانس 20 ضربة باستخدام مدقة من النوع B على الجليد.
  4. جهاز طرد مركزي عند 2000 جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. (يحتوي المادة الطافية على السيتوبلازم ، وهو غير ضروري لهذا البروتوكول ، ولكن يمكن حفظه لاستخدامات أخرى إذا رغبت في ذلك).
  5. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من الغسيل البارد المثلج C (مع مثبطات البروتياز).
  6. ضع طبقة من المادة المعلقة فوق 5 مل 30٪ وسادة سكروز ، ثم جهاز طرد مركزي على وزن 2400 جم لمدة 5 دقائق في دوار دلو متأرجح. سوف تهاجر النوى عبر الوسادة ، ويبقى الحطام في الواجهة.
  7. قم بإزالة كل حجم السائل بعناية وأعد تعليق النوى في 250 ميكرولتر من مثبطات الغسيل البارد C + البروتياز.
< p class = "jove_title" >3. عزل النيوكليوزومات عن طريق هضم Nuclease Microcolical (MNase) في الموقع

نستخدم إجراء يتم فيه هضم الكروماتين في الموقع داخل النوى عن طريق غرسها ب MNase ، متبوعا بعلاج ناقص التوتر لدفع النيوكليوسومات الحرة السليمة إلى المادة الطافية.

  1. أضف 3 ميكرولتر 0.1 م CaCl2 إلى العينة. ضع في كتلة حرارية 37 درجة مئوية. دعه يفترض درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  2. أضف 2 وحدة MNase (Nuclease Micrococcal ، Sigma-Aldrich ، مذاب عند 2 وحدة / 10 ميكرولتر في المخزن المؤقت MNase) ، ثم احتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة ، مع الخلط المتكرر باستخدام طرف الماصة.
  3. أضف 6 ميكرولتر من 0.5 M Na-EDTA ، الرقم الهيدروجيني 8.0 لإيقاف التفاعل. ضع على الجليد.
  4. جهاز طرد مركزي بوزن 2000 جرام لمدة 4 دقائق ، تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر 0.2 ملي Na-EDTA. يحفظ على الثلج لمدة 1 ساعة مع الأنابيب اللطيفة من حين لآخر. (هذه الظروف تحت التوتر تحرر النيوكليوسومات الحرة من النوى).
  5. جهاز طرد مركزي عند 3000 جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. احتفظ بالمادة الطافية ، التي تحتوي على نيوكليوسومات حرة ، على الجليد.
  6. أعد تعليق الحبيبات مرة أخرى باستخدام 300 ميكرولتر 0.2 ملي Na-EDTA. يحفظ على الثلج لمدة 1 ساعة مع الأنابيب اللطيفة من حين لآخر.
  7. جهاز طرد مركزي عند 3000 جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. احتفظ بالمادة الطافية واجمعها مع أول طافي من الخطوة 5. يمكن اقتباس المستحضرات أحادية النوكليوسوم الناتجة وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
< p class = "jove_content" >ملاحظة: يمكن قياس كمية الكروماتين بشكل فظ عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر من عينة 10 ميكرولتر مضافة إلى 990 ميكرولتر من الماء. A260 = 10 (بعد تعديل التخفيف 1/100) يتوافق مع حوالي 1 مجم / مل من الكروماتين. أيضا ، أثناء الإجراء أعلاه ، يمكن الاحتفاظ بعينات صغيرة وتحليلها لاحقا لمحتوى الحمض النووي الخاص بها لمراقبة جودة ومدى هضم MNase ، والذي يجب أن يحتوي في الغالب على حمض نووي يبلغ طوله 146 نقطة أساس. يدل السلم على عدم اكتمال هضم MNase.

ملاحظة: يحتوي الشكل 1 على ملخص تخطيطي لخطوات الهضم النووي وMNase.

< p class = "jove_title" >4. النيوكليوسوم - إليسا (NU-ELISA)

نكتشف PTMs على الكسور التي تحتوي على نوكليات سليمة أصلية تم تجميدها على 96 لوحة ميكروتيتر ELISA جيدا. لكل عينة ، نقوم بعمل سلسلة من التخفيفات 2 أضعاف ، ويتم تغليفها على الآبار بثلاث نسخ.

  1. قم بتغطية ألواح MaxiSorp طوال الليل عند 4 درجات مئوية ب 50 ميكرولتر / بئر من النيوكليوسومات المخففة في محلول الطلاء. يتم تحضير التخفيفات التسلسلية المزدوجة المقترحة للنيوكليوسومات من الصف العلوي إلى الصف السفلي بإضافة 0.1 ميكروغرام ، 0.05 ميكروغرام ، 0.025 ميكروغرام ، 0.0125 ميكروغرام ، 0.00625 ميكروغرام ، 0.00313 ميكروغرام ، 0.00156 ميكروغرام ، مع مخزن مؤقت للطلاء فقط (0 ميكروغرام كروماتين) في الصف السفلي. (ملاحظة: هناك حاجة إلى أغطية الألواح لهذه الخطوة.)
  2. في الصباح ، اغسل الألواح 4 مرات باستخدام 200 ميكرولتر / بئر PBS / 0.5٪ Tween-20 في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق باستخدام غسالة الألواح.
  3. كتلة 1 ساعة في RT مع 100 ميكرولتر / بئر PBS / 0.05٪ توين -20 / 5٪ BSA.
  4. قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب عن طريق هز اللوحة المقلوبة بسرعة فوق الحوض. قم بتغطية الأطباق وتخزينها عند -20 درجة مئوية ، أو انتقل مباشرة إلى الخطوة التالية.
  5. أضف 1 درجة ABS بحجم 50 ميكرولتر / مخفف جيدا 1: 1000 (أو حسب الحاجة) في PBS / 0.05٪ Tween-20/5٪ BSA ، احتضان في RT لمدة ساعة واحدة على المدور.
  6. اغسل الألواح 4 مرات باستخدام 200 ميكرولتر / بئر PBS / 0.5٪ Tween-20 في RT ولمدة إجمالية تبلغ 10 دقائق في غسالة الألواح.
  7. أضف فجل الحصان بيروكسيداز (HRP) المترافق 2 درجة ABS ، مخفف 1: 5000 (أو حسب الحاجة) في PBS / 0.05٪ Tween-20 / 5٪ BSA في RT لمدة ساعة على المدور.
  8. اغسل الألواح 4 مرات ب 200 ميكرولتر / بئر PBS / 0.5٪ Tween-20. كل غسلة في RT ولمدة 10 دقائق بغسالة لوحة.
  9. قم بتطوير الألواح عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من ركيزة TMB إلى كل بئر لمدة 10 دقائق في RT. أوقف التفاعل بإضافة 50 ميكرولتر / بئر من 2N H2SO4 واقرأ الألواح 450 نانومتر. (نصيحة: جهاز طرد مركزي عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين باستخدام دوار اللوحة لتبديد أي فقاعات هواء في الآبار قبل قراءة الامتصاص).
  10. تصدير القراءات إلى ملفات جداول البيانات للتحليلات الكمية والإحصائية.

الكواشف

برنامج تلفزيوني / الزبدات 135 ملي كلوريد الصوديوم 2.5 ملي كلوريد الرأس 8 ملي أمبيريNa 2HPO4 1.5 ملي مولار كيلو هرتز2نقطة4 10 ملي من Na-butyrate عازلة التحلل 250 ملي من السكروز 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 7.4 10 ملي من Na-butyrate 4 ملي ملغن كلوريد2 0.1٪ تريتون X-100 عازلة الغسيل C 250 ملي من السكروز 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 7.4 10 ملي من Na-butyrate 4 ملي ملغن كلوريد2 وسادة السكروز 30٪ (وزن / حجم) من السكروز في محلول الغسيل C عازلة Nuclease Microccocal 5 ملي مولار NaPO4 عازلة ، درجة الحموضة 7.0 0.025 ملي كلوريدالهواء 2 طلاء عازلة 80 مل محلول أ + 170 مل محلول ب + 250 مل دي سيإم 2س الحل أ: 0.2 م Na2CO3 الحل ب: 0.2 م NaHCO3 < p class = "jove_title" >5. النتائج التمثيلية

باستخدام طريقة NU-ELISA ، يتم تحضير سلسلة من عدة ألواح متطابقة يمكن تحميلها بالكروماتين المحضر على شكل أحادي النوكليوسومات. نقوم عادة بإعداد سلسلة من اللوحات المحملة بشكل متطابق بحيث يمكن فحص كل منها بأجسام مضادة مختلفة مضادة ل PTM (Abs). نقوم دائما بإعداد لوحة يمكن فحصها باستخدام Ab الذي يكتشف الهستونات بغض النظر عن حالة التعديل ، والتحكم الكلي في تحميل الكروماتين. يعد هذا التحكم ضروريا من أجل مقارنة محتوى PTM للنيوكليوسومات المحضرة من عينات مختلفة كميا لاحقا. لتقدير مستويات PTMs داخل عينة كروماتين معينة ، نقوم بتصحيح قيم الامتصاص الخام باستخدام هذا النهج: أولا ، نطرح أي إشارة خلفية باستخدام القيم التي تم الحصول عليها من آبار التحكم التي لا تحتوي على كروماتين (عادة ما تكون الخلفية ضئيلة). ثم نقوم بتوحيد الإشارات الخاصة ب PTM لنتائج NU-ELISA التي تم الحصول عليها من لوحة محملة بشكل متطابق تم فحصها باستخدام Ab الذي يكتشف النيوكليوسومات بشكل مستقل عن حالة تعديلها. (لقد استخدمنا عضلات البطن متعددة النسيلة الخاصة بهستونات H2A أو H2B لهذا الغرض). ثم نحدد الوسائل والفروق لكل تخفيف للكروماتين ، ونستخدم البيانات التي تم الحصول عليها من الجزء الخطي من مقايسة ELISA. تم الإبلاغ عن أمثلة مفصلة للتحليلات الرياضية والإحصائية ل NU-ELISAسابقا 4

figure-protocol-1
الشكل 1. التخطيطي لخطوات NU-ELISA. أ. يتم حصاد خلايا الثدييات. ب. يتم فصل النوى عن الخلايا عن طريق التجانس Dounce ، C. يتم تحميل الخلايا المعطلة فوق وسادة سكروز 30٪ وزن / حجم ، D. بعد الطرد المركزي ، يتم ترسيب النوى في الحبيبات. ه، و. يتم هضم الكروماتين في الموقع إلى أحادي النواة في الغالب بواسطة MNase. جي ، ح ، أنا. يتم استخراج أحادي النوكليوسومات القابلة للذوبان عن طريق المعالجة منخفضة التوتر والطرد المركزي المتكرر للمواد النووية المتبقية. ي. يتم طلاء أحادي النوكليوسومات من عينات مختلفة (المسمى السامب. 1 و 2 في هذه الحالة) على آبار ميكروتيتر في سلسلة من الألواح المحملة بشكل متماثل ويتم استجوابها باستخدام ABS الخاص ب PTM و ABS المستقل عن PTM لتحديد تحميل الكروماتين الكلي. ك. تصوير مستويات الكشف عن الإشارة التفاضلية في عينتين تختلفان في محتوى PTM ، ومع ذلك لهما محتوى كروماتين إجمالي مماثل ، كما هو محكوم عليه من خلال التفاعل المناعي المضاد ل H2B.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر NU-ELISA طريقة للتأكد من الوضع العالمي ل PTMs النووية الموجودة داخل نوع معين من الخلايا. أظهرت دراسات NU-ELISA أن حالات تعديل النيوكليوسوم العالمية تختلف في مقارنات أنواع الخلايا المتباينة 4. بالإضافة إلى ذلك ، تتغير ملامح NU-ELISA PTM عندما تتعرض الخلايا لعوامل تعديل لاجينية مثل trichostatin-A أو عندما يتم تمييز الخلايا الجذعية الجينية للفأر 4. كما تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لدراسة الكروماتين في خلايا الجذعية الجنينية البشرية5. من المهم ملاحظة أن NU-ELISA ، في شكله الحالي ، يمكنه اكتشاف التوقيع المركب ل PTMs الموجود ضمن المجموع الكلي للجينوم الخلوي. يختلف هذا بشكل ملحوظ عن الترسيب المناعي للكروماتين على مستوى الجينوم ، والذي يمكن أن يحدد توزيع PTM معين عبر مواقع وراثية محددة.

تم تكييف الخطوات الأولية لإجراءات NU-ELISA من الطرق السابقة لعزل أحاديات النوكليوسوم من نوى الثدييات6،7. توفر هذه الطرق المكيفة طريقة ملائمة للحصول على أحاديات النوكليوسوم السليمة عالية الجودة من خلايا الثدييات ، والكسور الناتجة شاملة في محتواها من الكروماتين ، ولكنها تحتوي على قدر كبير من المواد النووية الإضافية. نظرا لاستخدام عضلات البطن المحددة ، يتم تحمل المواد غير النووية الملوثة جيدا في مقايسة NU-ELISA ، على عكس مناهج المواصفات الشاملة التي تتطلب نقاوة أكبر. ومع ذلك ، فإن NU-ELISA أكثر حساسية وكمية من النشاف الغربي 4 ، مما يوفر بدائل جيدة للغربيين والمواصفات الجماعية للكشف عن PTMs النووي.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم تطوير طريقة NU-ELISA من خلال RO1AG023687 منح المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نوى المكورات الدقيقةسيجما-ألدريتشN3755جعل الحصص من 2 U / 10 μ ؛ ل المخزن المؤقت ، المخزنة في -20 ° ؛ C
Nunc MaxiSorp Microtiter PlatesFisher Scientific12-565-135يمكن أيضا طلب أغطية الألواح اللاصقة من خلال Fisher
Automated Plate Washer
1-Step TMB-ELISAsubstratePierce ، Thermo Scientific34028Store at 4 ° ؛ C قبل التسخين إلى RT قبل الاستخدام أو حسب التوجيهات في ورقة المواصفات
Microtiter Plate Reader Bio-Radمعظم موديلات قارئ الألواح اللونية مناسبة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  2. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
  3. Turner, B. M. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays. 22, 836-845 (2000).
  4. Dai, B., Rasmussen, T. P. Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells. Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).
  5. Tanasijevic, B. Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture. Epigenetics. 4, 330-338 (2009).
  6. Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).
  7. Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nucleosome ELISAPost translational ModificationsNucleosome IsolationChromatin DigestionHistone ModificationsEpigenetic AnalysisWestern Blot AlternativeCell Nuclei PreparationMicrococcal Nuclease TreatmentELISA Substrate Detection

Related Articles