يعتبر مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم للنيوكليوسوم (NU-ELISA) طريقة حساسة وكمية للكشف عن الأنماط العامة للتعديلات ما بعد الترجمة في تحضيرات النيوكليوسومات الأصلية والسليمة. وتشمل هذه التعديلات عمليات الميثيلة، والأستلة، والفسفرة عند بقايا أحماض أمينية محددة في الهيستونات، وبالتالي توفر تقنية NU-ELISA مقايسة بروتيومية شاملة لحالات تعديل الكروماتين الإجمالية لأنواع خلوية محددة.
مقالة منهجية
الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوجد جينوم حقيقيات النوى على شكل كروماتين يحتوي على كل من DNA والبروتينات. والوحدة الأساسية للكروماتين هي النيوكليوسوم، والتي تحتوي على 146 زوجاً قاعدياً من DNA مرتبطة بكل من هيستونات H2A وH2B وH3 وH4 بواقع اثنين من كل نوع1. وتكون الذيول الطرفية النيتروجينية (N-terminal) للهيستونات غنية باللايسين والأرجنين، وتخضع لتعديلات بعد النسخ عن طريق الأسيتلة والمثيلة وتعديلات أخرى ما بعد الترجمة (PTMs). ويمكن لتكوين تعديلات ما بعد الترجمة في النيوكليوسومات أن يؤثر على النشاط النسخي لـ DNA المرتبط بها، مما يوفر نمطاً من تنظيم الجينات ذا طبيعة فوق جينية 2,3. لقد طورنا طريقة تسمى مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم للنيوكليوسومات (NU-ELISA) لتحديد بصمات تعديلات ما بعد الترجمة الشاملة للنيوكليوسومات المستخلصة من الخلايا كمياً. وتعد تقنية NU-ELISA أكثر حساسية وكمية من طريقة لطخة ويسترن (western blotting)، وهي مفيدة لاستقصاء الحالة البروتينية فوق الجينية لأنواع محددة من الخلايا. ويعرض مقال الفيديو هذا الإجراءات التفصيلية لإجراء تحليل NU-ELISA.
البروتوكول
1. زراعة الخلايا الثديية
يمكن إجراء اختبار NU-ELISA على أي نوع من الخلايا الثديية التي يمكن زراعتها مخبرياً. ونحن نفضل تحضير دفعات متوسطة إلى كبيرة من الخلايا بحيث يمكن عزل النيوكليوسومات بكمية كافية لتحضير عدة أطباق ELISA محملة بشكل متماثل، مما يسمح بإجراء مقاييس باستخدام عدة أجسام مضادة (Abs) مختلفة. وتوفر مقاييس الزراعة التالية مواد كافية:
بالنسبة للخلايا الجذعية الجنينية للفئران، يتم استزراع طبق واحد أو طبقين بقطر 15 cm من الخلايا بدون خلايا مغذية. أما بالنسبة للأرومات الليفية، فيتم استزراع من 5 إلى 10 أطباق بقطر 15 cm حتى تصل إلى مرحلة التلاقي.
2. عزل النوى
ملاحظة: تُجرى جميع الخطوات على الثلج باستخدام محاليل منظمة مبردة مسبقاً، ما لم يُذكر خلاف ذلك.
- قم بمعالجة الخلايا بالتربسين باستخدام 3 ml من التربسين لكل طبق، ثم اجمعها وأضف 20 ml من محلول PBS/butyrate المبرد بالثلج. قم بالطرد المركزي بسرعة 1000 rpm لمدة 5 min.
- أعد تعليق الخلايا في 10 ml من محلول PBS/butyrate وقم بالطرد المركزي بسرعة 1000 rpm لمدة 5 min.
- أعد تعليق الخلايا في 4 ml من محلول التحلل (lysis buffer) مع مثبطات البروتياز (Sigma-Aldrich P-8340). قم بالتجانس باستخدام جهاز Dounce لمدة 20 ضربة بمدقة من النوع B على الثلج.
- قم بالطرد المركزي بقوة 2000g لمدة 10 min عند درجة حرارة 4°C. (يحتوي السائل العلوي على السيتوبلازم، وهو غير مطلوب في هذا البروتوكول، ولكن يمكن حفظه لاستخدامات أخرى إذا رغبت في ذلك).
- أعد تعليق الراسب في 2 ml من محلول الغسيل C المبرد بالثلج (مع مثبطات البروتياز).
- ضع المادة المعاد تعليقها فوق طبقة وسادة من السكروز بتركيز 30% بحجم 5 ml، ثم قم بالطرد المركزي بقوة 2400g لمدة 5 min باستخدام دوّار ذي دلاء متأرجحة. ستنتقل النوى عبر الوسادة، بينما تبقى الحطام عند السطح الفاصل.
- أزل كامل حجم السائل بعناية وأعد تعليق النوى في 250 μl من محلول الغسيل C المبرد بالثلج + مثبطات البروتياز.
3. عزل النيوكليوسومات عن طريق الهضم بإنزيم النيوكلياز الميكروكوكال (MNase) في الموقع in situ
نستخدم إجراءً يتم فيه هضم الكروماتين in situ داخل النوى عن طريق حقنها بـ MNase، يليه معالجة بنقص التوتر لضمان دفع النيوكليوسومات السليمة الحرة إلى الطافي.
- أضف 3 μl من CaCl2 بتركيز 0.1 M إلى العينة. ضعها في كتلة تسخين عند درجة حرارة 37°C، واترك العينة حتى تصل درجة حرارتها إلى 37°C.
- أضف وحدتين من MNase (Micrococcal Nuclease، من شركة Sigma-Aldrich، مُذاب بتركيز وحدتين/10μl في محلول MNase buffer)، ثم حضن العينة عند درجة حرارة 37°C لمدة 12 دقيقة، مع الخلط المتكرر باستخدام طرف الماصة.
- أضف 6 μl من Na-EDTA بتركيز 0.5 M ورقم هيدروجيني pH 8.0 لإيقاف التفاعل. ضع العينة على الثلج.
- قم بالطرد المركزي عند 2000g لمدة 4 دقائق، ثم تخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الراسب في 300 μl من Na-EDTA بتركيز 0.2 mM. احفظ العينة على الثلج لمدة ساعة واحدة مع إجراء عملية السحب والضخ بالماصة برفق من حين لآخر. (تعمل هذه الظروف ناقصة التوتر على تحرير النيوكليوسومات الحرة من النوى).
- قم بالطرد المركزي عند 3000 g لمدة 4 دقائق عند درجة حرارة 4°C. احفظ السائل الطافي، الذي يحتوي على النيوكليوسومات الحرة، على الثلج.
- أعد تعليق الراسب مرة أخرى باستخدام 300 μl من Na-EDTA بتركيز 0.2 mM. احفظ العينة على الثلج لمدة ساعة واحدة مع إجراء عملية السحب والضخ بالماصة برفق من حين لآخر.
- قم بالطرد المركزي عند 3000g لمدة 4 دقائق عند درجة حرارة 4°C. احتفظ بالسائل الطافي واجمعه مع السائل الطافي الأول من الخطوة 5. يمكن تقسيم تحضيرات النيوكليوسوم الأحادي الناتجة إلى حصص وتخزينها عند درجة حرارة -80°C.
ملاحظة: يمكن تقدير كمية الكروماتين بشكل تقريبي عن طريق قياس الامتصاصية عند 260 nm لعينة بحجم 10 μl مضافة إلى 990 μl من الماء. حيث تعادل قيمة A260=10 (بعد التعديل وفقاً للتخفيف بنسبة 1/100) حوالي 1mg/ml من الكروماتين. أيضاً، خلال الإجراء المذكور أعلاه، يمكن الاحتفاظ بعينات صغيرة وتحليل محتواها من الـ DNA لاحقاً لمراقبة جودة ومدى الهضم بإنزيم MNase، والذي يجب أن يحتوي بشكل أساسي على DNA بطول 146 bp. ويشير ظهور نمط السلم (Laddering) إلى عدم اكتمال عملية الهضم بإنزيم MNase.
ملاحظة: يحتوي الشكل 1 على ملخص تخطيطي لخطوات عزل النواة وهضم إنزيم MNase.
4. مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم للنوكليوزوم (NU-ELISA)
نقوم بالكشف عن تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) في الكسور التي تحتوي على نيوكليوسومات أصلية سليمة تم تثبيتها على ألواح ميكروتيتر ELISA ذات 96 بئراً. ولكل عينة، نقوم بإجراء سلسلة من التخفيفات بمعدل 2-fold، ثم نغلف بها الآبار في ثلاث مكررات.
- يتم تغليف ألواح MaxiSorp طوال الليل عند درجة حرارة 4°C بإضافة 50 μl/well من النيوكليوسومات المخففة في محلول التغليف المنظم. تُحضر تخفيفات تسلسلية مضاعفة مقترحة للنيوكليوسومات من الصف العلوي إلى الصف السفلي بإضافة 0.0125 μg، و0.00625 μg، و0.00313 μg، و0.00156 μg، و0.025 μg، و0.05 μg، و0.1 μg، مع وضع محلول التغليف المنظم فقط (0 μg من الكروماتين) في الصف السفلي. (ملاحظة: يلزم استخدام أغطية الألواح في هذه الخطوة).
- في الصباح، تُغسل الألواح 4 مرات باستخدام 200 μl/well من PBS/0.5% Tween-20 في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة إجمالية تبلغ 10 دقائق باستخدام غسالة الألواح.
- يتم الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام 100 μl/well من PBS/0.05% Tween-20/5% BSA.
- يُزال محلول الحجب عن طريق هز اللوح المقلوب بقوة فوق حوض الغسيل. تُغطى الألواح وتُخزن عند درجة حرارة -20°C، أو يتم الانتقال مباشرة إلى الخطوة التالية.
- يُضاف الجسم المضاد الأولي (1° Abs) بحجم 50 μl/well مخفف بنسبة 1:1000 (أو حسب الحاجة) في PBS/0.05% Tween-20/5% BSA، ويُحضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة ساعة واحدة على جهاز دوار.
- تُغسل الألواح 4 مرات باستخدام 200 μl/well من PBS/0.5% Tween-20 في درجة حرارة الغرفة (RT) ولمدة إجمالية قدرها 10 دقائق في غسالة الألواح.
- يُضاف الجسم المضاد الثانوي (2° Abs) المقترن بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP)، مخفف بنسبة 1:5000 (أو حسب الحاجة) في PBS/0.05% Tween-20/5% BSA في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة ساعة واحدة على جهاز دوار.
- تُغسل الألواح 4 مرات باستخدام 200 μl/well من PBS/0.5% Tween-20. تتم كل عملية غسل في درجة حرارة الغرفة (RT) ولمدة إجمالية قدرها 10 دقائق باستخدام غسالة الألواح.
- يتم إظهار التفاعل في الألواح بإضافة 50 μl من ركيزة TMB إلى كل بئر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). يتم إيقاف التفاعل بإضافة 50 μl/well من 2N H2SO4 وقراءة الألواح عند 450 nm. (نصيحة: يتم الطرد المركزي بسرعة 1500 rpm لمدة دقيقتين باستخدام دوار ألواح لتشتيت أي فقاعات هواء في الآبار قبل قراءة الامتصاصية).
- يتم تصدير القراءات إلى ملفات جداول البيانات لإجراء التحليلات الكمية والإحصائية.
الكواشف
| محلول ملحي منظم بالفوسفات/بوتيرات |
| 135 ملي مولار NaCl |
| 2.5 ملي مولار من KCl |
| 8 ملي مولار من Na2تحسين المعاملات الفائقة (HPO)4 |
| ١,٥ ملي مولار من KH2تأكسد الفوسفور (PO)4 |
| ١٠ مللي مولار من بوتيرات الصوديوم (Na-butyrate) |
| محلول التحلل المنظم |
| سكروز بتركيز 250 ميلي مولار |
| ١٠ ملي مولار Tris-HCl، الرقم الهيدروجيني ٧.٤ |
| 10 ملي مولار من بوتيرات الصوديوم (Na-butyrate) |
| 4 ملي مولار من MgCl22 |
| 0.1% Triton X-100 |
| محلول الغسيل المنظم ج |
| سكروز بتركيز 250 ملي مولار |
| 10 ملي مولار من Tris-HCl، الرقم الهيدروجيني 7.4 |
| 10 ملي مولار من بوتيرات الصوديوم (Na-butyrate) |
| ٤ مللي مولار من MgCl22 |
| وسادة السكروز |
| سكروز بنسبة 30% (وزن/حجم) في محلول الغسل C |
| محلول منظم لإنزيم نوكلييز المكورات العنقودية |
| ٥ ملي مولار NaPO4 محلول منظم، الرقم الهيدروجيني 7.0 |
| 0.025 ملي مولار CaCl22 |
| محلول التغطية المنظم |
| ٨٠ مل من المحلول أ + ١٧٠ مل من المحلول ب + ٢٥٠ مل من الماء المقطر (dH)2O |
| المحلول أ: 0.2 مولار من Na2أول أكسيد الكربون3 |
| المحلول ب: 0.2 مولار NaHCO33 |
5. النتائج التمثيلية
باستخدام طريقة NU-ELISA، يتم تحضير سلسلة من عدة أطباق متماثلة يمكن تحميلها بالكروماتين المحضر على شكل نوكليوسومات أحادية. نقوم عادةً بتحضير سلسلة من الأطباق المحملة بشكل متماثل بحيث يمكن فحص كل منها باستخدام أجسام مضادة (Abs) مختلفة ومحددة ضد تعديلات ما بعد الترجمة (PTM). كما نقوم دائماً بتحضير طبق يمكن فحصه بجسم مضاد يكشف عن الهستونات بغض النظر عن حالة تعديلها، وذلك كعنصر تحكم في إجمالي تحميل الكروماتين. هذا التحكم ضروري من أجل مقارنة كمية محتوى PTM للنوكليوسومات المحضرة من عينات مختلفة لاحقاً. ولتقدير مستويات PTM ضمن عينة كروماتين معينة، نقوم بتصحيح قيم الامتصاص الخام باستخدام هذا النهج: أولاً، نطرح أي إشارة خلفية باستخدام القيم التي تم الحصول عليها من آبار التحكم التي لا تحتوي على كروماتين (عادةً ما تكون الخلفية مهملة). ثم نقوم بتوحيد الإشارات المحددة لـ PTM وفقاً لنتائج NU-ELISA التي تم الحصول عليها من طبق محمل بشكل متماثل تم فحصه بجسم مضاد يكشف عن النوكليوسومات بشكل مستقل عن حالة تعديلها. (لقد استخدمنا أجساماً مضادة متعددة النسائل محددة للهستونات H2A أو H2B لهذا الغرض). بعد ذلك، نحدد المتوسطات والتباينات لكل تخفيف من الكروماتين، ونستخدم البيانات التي تم الحصول عليها من الجزء الخطي لمقايسة ELISA. وقد تم تقرير أمثلة تفصيلية للتحليلات الرياضية والإحصائية لـ NU-ELISA سابقاً4
الشكل 1. مخطط توضيحي لخطوات تقنية NU-ELISA. أ. يتم حصاد الخلايا الثديية؛ ب. يتم فصل النوى عن الخلايا بواسطة التجانس باستخدام جهاز Dounce، ج. تُوضع الخلايا الممزقة فوق وسادة سكروز بتركيز 30% w/v، د. بعد الطرد المركزي، تترسب النوى في الراسب؛ هـ، و. يتم هضم الكروماتين in situ إلى نيوكليوسومات أحادية بشكل أساسي بواسطة MNase؛ ز، ح، ط. يتم استخلاص النيوكليوسومات الأحادية الذائبة عن طريق المعالجة بمحلول ناقص التوتر والطرد المركزي المتكرر للمواد النووية المتبقية. ي. يتم طلاء النيوكليوسومات الأحادية من عينات مختلفة (المشار إليها بالعينة 1 و2 في هذه الحالة) على آبار لوحات معايرة دقيقة في سلسلة من الأطباق المحملة بشكل متماثل، ويتم فحصها باستخدام أجسام مضادة نوعية لـ PTM وأجسام مضادة غير معتمدة على PTM لتحديد إجمالي تحميل الكروماتين. ك. تصوير لمستويات الكشف عن الإشارات التفاضلية في عينتين تختلفان في محتوى PTM الخاص بهما، ومع ذلك تمتلكان محتوى كروماتين إجمالي مماثل، بناءً على التفاعلية المناعية لـ anti-H2B.
المناقشة
توفر تقنية NU-ELISA طريقة لتحديد الحالة العامة لتعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) للنوكليوسومات الموجودة ضمن نوع خلوي معين. وقد أظهرت دراسات NU-ELISA أن حالات تعديل النوكليوسومات العامة تختلف عند مقارنة أنواع خلوية متباينة 4. بالإضافة إلى ذلك، تتغير ملفات PTMs الخاصة بتقنية NU-ELISA عندما تتعرض الخلايا لعوامل تعديل فوق جينية مثل trichostatin-A أو عند تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفئران 4. كما تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لدراسة الكروماتين في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية5. ومن المهم ملاحظة أن تقنية NU-ELISA، بصيغتها الحالية، يمكنها الكشف فقط عن البصمة المركبة لـ PTMs الموجودة ضمن المجموع الكلي للإبيجينوم الخلوي. وهذا يختلف بشكل ملحوظ عن الترسيب المناعي للكروماتين على مستوى الجينوم، والذي يمكنه تحديد توزيع PTM محدد عبر مواقع جينية محددة.
تم تكييف الخطوات الأولية لإجراءات NU-ELISA من طرق سابقة لعزل المونو-نيوكليوسومات من نوى الثدييات6,7. وتوفر هذه الطرق المكيفة وسيلة ميسرة للحصول على مونو-نيوكليوسومات سليمة وعالية الجودة من خلايا الثدييات، وتكون الأجزاء الناتجة شاملة في محتواها من الكروماتين، ولكنها تحتوي على قدر كبير من المواد النووية الإضافية. وبما أنه يتم استخدام أجسام مضادة (Abs) محددة، فإن المواد غير النيوكليوسومية الملوثة يتم تحملها جيداً في مقايسة NU-ELISA، على عكس مناهج مطيافية الكتلة التي تتطلب نقاءً أكبر. ومع ذلك، فإن NU-ELISA أكثر حساسية وكمية من لطخة ويسترن 4، مما يوفر بدائل جيدة للطخات والتحليل بمطيافية الكتلة للكشف عن التعديلات ما بعد الترجمية (PTMs) للنيوكليوسومات.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن وجود أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم تطوير طريقة NU-ELISA من خلال منحة NIH رقم RO1AG023687.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Micrococcal Nucleae | Sigma-Aldrich | N3755 | يتم تحضير حصص مقدارها 2 U/10μl من المحلول المنظم، وتُخزن عند -20°C |
| أطباق Nunc MaxiSorp Microtiter | Fisher Scientific | 12-565-135 | يمكن أيضاً طلب أغطية الأطباق اللاصقة من خلال Fisher |
| جهاز غسل الأطباق الآلي | |||
| ركيزة 1-Step TMB-ELISA | Pierce, Thermo Scientific | 34028 | تُخزن عند 4°C وتُسخن مسبقاً لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام أو وفقاً للإرشادات الواردة في ورقة المواصفات |
| قارئ أطباق Microtiter | Bio-Rad | تعتبر معظم طرازات قارئ الأطباق اللونية مناسبة |
المراجع
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Turner, B. M. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays. 22, 836-845 (2000).
- Dai, B., Rasmussen, T. P. Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells. Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).
- Tanasijevic, B. Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture. Epigenetics. 4, 330-338 (2009).
- Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).
- Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).
إعادة الطباعة والأذونات
