الزاجل فحوصات تنافسية لدراسة غوت - مدار هجرة الخلايا التائية

ملخص

تجارب صاروخ موجه تنافسية تسمح لتقييم الخصائص الكثيرة مباشرة من اثنين من السكان مختلفة من الخلايا في ماوس واحدة. نحن هنا لتوضيح هذا الإجراء من خلال مقارنة الهجرة من خارج الحي ولدت مدار - الأمعاء مقابل عدم الأمعاء مدار الخلايا التائية.

الملخص

من أجل ممارسة وظيفتها اللمفاويات الحاجة إلى مغادرة الدم وتهاجر إلى الأنسجة المختلفة في الجسم. التصاق الخلايا اللمفاوية لخلايا بطانة الأوعية الدموية والأنسجة التسرب هو عملية متعددة الخطوات التي تسيطر عليها التصاق جزيئات مختلفة (صاروخ موجه المستقبلات) في الخلايا الليمفاوية وأعرب كل منهما يغاندس (addressins) المعروضة على الخلايا البطانية ^{1 2.} على الرغم من يمكن أن تكون وظيفة هذه المستقبلات التصاق درس جزئيا خارج الحي ، والاختبار النهائي لأهميتها الفسيولوجية هو تقييم دورها في خلال التصاق الخلايا اللمفاوية فيفو والهجرة. وقد استخدمت استراتيجيتين تكميلية لهذا الغرض : intravital المجهري (IVM) ، وتجارب صاروخ موجه. على الرغم من IVM كانت ضرورية لتحديد دقيق للمساهمة مستقبلات الالتصاق محددة خلال تتالي التصاق في الوقت الحقيقي والأنسجة المختلفة ، IVM تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة ، فإنه غالبا ما يتطلب تطوير تقنيات جراحية متطورة ، فإنها بحاجة إلى العزلة من قبل متجانسة السكان الخلية ويسمح تحليل واحد فقط الجهاز / الأنسجة في أي وقت من الأوقات. على النقيض من ذلك ، والتجارب صاروخ موجه تنافسية تسمح المقارنة المباشرة والفورية في الهجرة من اثنين (أو أكثر) مجموعات فرعية خلية في الماوس نفسه ، وأنها تسمح أيضا تحليل العديد من الأنسجة وعدد كبير من الخلايا في التجربة نفسها.

نحن هنا وصف الكلاسيكية بروتوكول صاروخ موجه تنافسية استخدمت لتحديد ميزة / الحرمان من نوع الخلية بالنظر إلى المنزل لأنسجة معينة بالمقارنة مع التحكم في عدد السكان الخلية. اخترنا لتوضيح خصائص المهاجرة مدار - الأمعاء الأمعاء ، مقابل عدم مدار الخلايا التائية ، وذلك لأن الغشاء المخاطي المعوي هو السطح أكبر هيئة في اتصال مع البيئة الخارجية وأنه هو أيضا من خارج النسيج اللمفاوي أفضل مع متطلبات محددة المهاجرة . وعلاوة على ذلك ، فقد قرر العمل مؤخرا بأن فيتامين (أ) المستقلب جميع العابر حمض الريتينويك (RA) هي الآلية الرئيسية الجزيئية المسؤولة عن التصاق الأمعاء تحريض مستقبلات محددة (إنتغرين مستقبلات chemokine a4b7and CCR9) في الخلايا الليمفاوية. وبالتالي ، فإننا قادرون على توليد بسهولة أعداد كبيرة من فيفو السابقين الأمعاء ، وغير مدار الأمعاء ، عن طريق تنشيط الخلايا الليمفاوية مدار خلايا تي في وجود أو عدم وجود التهاب المفاصل الروماتويدي ، على التوالي ، والتي يمكن استخدامها أخيرا في التجارب صاروخ موجه التنافسية الموصوفة هنا.

البروتوكول

1. فيفو الجيل السابق من الخلايا T - هومينغ الأمعاء والسيطرة (انظر الشكل 1)

1. عزل splenocytes بواسطة يهرس one الطحال نوع من الفئران البرية. Resuspend تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 "في غرام × 400 إزالة طاف وليز خلايا الدم الحمراء عن طريق إعادة التعليق على بيليه خلية في 4 مل من تحلل ACK العازلة لمدة 2-3 دقائق. بعد ذلك ، أضف 5 مل من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 "في 400 XG وإزالة طاف.
2. Resuspend splenocytes إجمالي 1 × 10 ⁶ / مل في IMDM + 10 ٪ + 50 ملي FBS 2 - المركابتويثانول + البنسلين / الستربتوميسين (IMDM كاملة). فصل الخلايا في مجموعتين ، واحدة منها وتستكمل مع التهاب المفاصل الروماتويدي (أو الاصطناعية RAR ناهضات ، مثل Am80 أو Am580) إلى التركيز النهائي من 100-200 م ^3. وتنشيط خلايا تي في وجود التهاب المفاصل الروماتويدي أو منبهات RAR - upregulate a4b7and CCR9 وستصبح القناة الهضمية - مدار خلايا T ، في حين أن تنشيط خلايا تي من دون RA سوف تصبح خلايا T السيطرة.
3. إضافة 1،5-2،0 مل من خلية إلى تعليق كل بئر من لوحة 24 مغلفة جيدا في السابق مع CD3 المضادة (10 ملغ / مل) ، ومكافحة CD28 (10 ملغ / مل) ، واحتضان ثاني أكسيد الكربون بنسبة 37 في 5 ٪ درجة مئوية ₂ (لطلاء لوحة إضافة 500 مل / جيد المضادة للCD3 زائد مكافحة CD28 في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 ساعة في 37 ˚ C ، ويغسل ثم مرتين مع PBS مل 2).
4. من أجل تجنب فرط تي الخلية ، بعد 2-3 أيام نقل الخلية إلى تعليق لوحة جديدة 24 غير المصقول جيدا. لاحتضان 2-3 أيام إضافية. اعتمادا على كثافة الخلايا وانتشار وسائل الإعلام قد تصبح حمض (الصفراء) ، وفي هذه الحالة قد يكون من الضروري استبدال نصف وسائل الإعلام مع IMDM كاملة جديدة. حصاد الخلايا بعد 4-5 أيام (العد من اليوم 0).
5. غلة النهائي النموذجية هي 1-2 × 10 ⁶ خلايا T المستجيب / أيضا. لذا ، ينبغي على الأقل مطلي الآبار 12/09 من كل خلايا T - مدار الأمعاء والتحكم في الخلايا التائية النظام في نهاية المطاف مع 10-20 × 10 ⁶ في الخلايا التائية الشرط.

2. تحليل الأمعاء ، صاروخ موجه على مستقبلات الخلايا التائية تفعيلها

بعد 4-5 أيام للثقافة ينبغي أن نلاحظ تعبير عالية من الأمعاء ، صاروخ موجه مستقبلات a4b7and CCR9 على تنشيط خلايا تي في وجود منبهات RA أو RAR ، في حين أن سيطرة الخلايا التائية ينبغي أن يعبر عن مستويات منخفضة جدا من هذه المستقبلات ^4.

التدفق الخلوي (FACS) التحليل.

1. جمع ما بين 0،2-0،5 ⁶ خلايا X10 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 غرام عند 4 درجات مئوية.
2. احتضان المضادة للFITC - CD4 ، ومكافحة a4b7 - PE دينار بحريني (العلوم البيولوجية) ، ومكافحة CCR9 - APC (eBiosciences) والمضادة للCD8 PercP مقابل 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
3. بعد الحضانة ، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 ز 4 درجات مئوية. غسل وresuspend الخلايا في تلطيخ العازلة وتحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية.

3. تي وسم الخلية مع خلية بتتبع CFSE وCMTMR

1. ابقاء جميع الحلول في 37 درجة مئوية قبل البدء. غسل الأمعاء - مدار خلايا T (a4b7 ^{السامية} CCR9 ^{السامية)} ومراقبة الخلايا التائية (a4b7 ^{منخفضة / NEG} CCR9 ^{منخفضة / NEG)} مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة المصل. ضبط تركيز خلية T إلى 10-15 × 10 ⁶ / مل في برنامج تلفزيوني.
2. إضافة CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl استر) أو CMTMR (كلوروميثيل - بيروكسايد - الأميني tetramethylrhodamine) fluorophores إلى T - مدار الأمعاء والخلايا إما السيطرة T إلى تركيز النهائي من 5 ملم و10 مم ، على التوالي ، واحتضان دوامة برفق لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. فمن المستحسن لمبادلة labelings في نفسه أو في تجربة منفصلة من أجل استبعاد الآثار المحتملة للfluorophores الجوهرية بشأن الهجرة الخلايا التائية.
3. بعد الحضانة ، مع 1 إخماد حجم FBS واحتضان لمدة 1-5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تمييع 10 مرات مع PBS دافئة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 غرام. تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني وresuspend في IMDM كاملة.
4. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تكون مختلطة 10-20 × 10 ⁶ خلايا T في كل السكان بنسبة 1:1 ثم طرد في 300 x ج لمدة 5 دقائق. أخيرا ، resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني 200-250 مل من الدفء وحقن عن طريق الوريد الذيل.
5. لحساب نسبة المدخلات الدقيقة (مثالي على مقربة من 1) حفظ 5-10 مل من تعليق حقن الخلايا وتمييع مع 300 مل من برنامج تلفزيوني وتحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية.

4. تحليل الخلايا التائية هومينغ

على الرغم من أن الفئران يمكن تحليلها في نقاط زمنية مختلفة (بين 1 ساعة وعدة أيام بعد حقن الخلايا التائية) ، هو موثق من أفضل صاروخ موجه من الخلايا T - مدار الأمعاء بين 12-24 ساعة بعد الحقن. نقاط قتا أطول زيادة الآثار المحتملة للمتغيرات أخرى تؤثر على الخلايا النهائي الأرقام / النسب ، مثل الخلايا والخلايا التائية T الخروج من الخلية والأنسجة. بعد الفئران وينبغي عزل الموت الرحيم ، والمعلقات خلية من أنسجة عدة دون تأخير من أجل خفض موت الخلايا ، والتي قد تؤثر على العائدات والنتائج النهائية. أنسجة الفائدة الأمعاء الدقيقة والقولون والطحال والغدد الليمفاوية ، والبقع باير والكبد والرئتين والدم. إذا كانيتم حقن الخلايا التائية بحسن نية الوتر - مدار الخلايا التائية ، ينبغي لها أن المنزل على 5-10 مرات في المتوسط ​​أفضل (أو أعلى) في الغشاء المخاطي للأمعاء الدقيقة بالمقارنة مع سيطرة الخلايا التائية. ومع ذلك ، ينبغي أن الأنسجة الأخرى ، مثل الدم والطحال ، لا يحمل خلية T تفضيلية الهجرة. وقد تم عزل الخلايا الليمفاوية من الصفيحة المخصوصة المعوية وحجرة داخل الظهاري الموصوفة سابقا ^5.

1. FACS تلطيخ : أنت معلق عينات اعتمادا على الأرقام التي تم جمعها من الخلايا ، في مناطق ذات كثافة أعلى لا يتجاوز 3.0 × 10 ⁶ خلايا / مل. إذا مسانج CD45.1 ⁺ أو ⁺ Thy1.1 استخدمت الفئران كمتلقين ، ملطخة الخلايا مع علامة على مسانج المقابلة (على سبيل المثال ، أو CD45.2 Thy1.2) جنبا إلى جنب مع بعض علامة النسب (على سبيل المثال ، TCRbchain ، CD4 ، CD8 ، CD45.1 ⁺ / CD45.2 ^+).
2. أثناء التحليل FACS ، الخلايا المغلقة على علامة مسانج (مثل CD45.1) ، ثم على علامات نسب محددة (مثل CD4/CD8) وتحليلها من أجل النسب بين CMTMR والخلايا CFSE إيجابية.
3. وعادة ما يتم التعبير عن البيانات كما في فهرس الزاجل (مرحبا) ، الذي يحسب كما CFSE نسبة / CMTMR (أو CMTMR / CFSE) في كل الأنسجة مقسوما على نسبة المدخلات المقابلة (أنظر أدناه). إذا كانت نسبة المدخلات قريب جدا إلى 1 ، ثم نسب الأنسجة يكون معادلا لمرحبا.

مرحبا = CFSE _{الأنسجة} / CMTMR _{الأنسجة} : CFSE _{الإدخال} / CMTMR _مدخلات

وينبغي أيضا أن يكون الدم تحليلها بغية تحديد ما إذا كان يتم تمثيل السكان على السواء الخلايا التائية في الدورة الدموية أو إذا انخفضت فئة سكانية الخلايا التائية يتعلق الأخرى (على سبيل المثال ، من خلال محاصرة تفضيلية في الرئتين / الكبد أو انخفاض الجدوى). هذا قد يحدث عند مقارنة ساذجة أو يستريح الخلايا التائية الذاكرة مؤخرا مقابل تنشيط خلايا تي المستجيب ، لأن من الممكن محاصرة هذا الأخير إلى حد كبير في الرئتين. إذا كان مرحبا في الدم تختلف اختلافا كبيرا من 1 ، يمكن للمرء أن تطبيع مرحبا في الأنسجة التي مرحبا في الدم. ويمكن الحصول على الدم من خلال ثقب في القلب من تخدير الفئران (مع أو AVERTIN isofluorane قبل القتل الرحيم) وينبغي lysed مرتين مع العازلة ACK قبل استخدامه لتلوين FACS.

مرحبا تطبيع الدم = _{الأنسجة} / مرحبا _الدم

5. ممثل النتائج

وكانت الفئران المستلم (Thy1.1 ⁺⁾ euthanized18h حقن الخلايا آخر. وقد تولدت تعليق خلية من الطحال والغدد الليمفاوية الطرفية (PLN) ، والعقد اللمفاوية المساريقية (MLN) والأمعاء الصغيرة propia الصفيحة (LP). بعد أن تم صبغ الخلايا للThy1.2 وCD8 ومن ثم تحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية التي تبوب على خلايا قابلة للحياة Thy1.2 CD8 ^{+ +} ، والتي تم تحليلها في النهاية عن النسبة بين الخلايا CMTMR ⁺ (القناة الهضمية - مدار خلايا T) وCFSE ⁺ الخلايا (خلايا تي التحكم) مقسوما على نسبة المدخلات. ويمكن عرض النتائج على النحو المبين في الشكل 2 ، والتي يمكن أن تقدر الأمعاء ، والسيطرة مدار الخلايا التائية المخزن بالتساوي على الطحال (مرحبا قريبة to1 ، أشار مع خط أحمر). على النقيض من ذلك ، الأمعاء ، مدار الخلايا التائية هاجر حوالي 10 مرات أكثر كفاءة ليرة لبنانية مقارنة للسيطرة على الخلايا التائية.

رسم بياني يظهر معزولة الجيل ووضع العلامات على مدار - الأمعاء والقناة الهضمية غير الخلايا التائية مدار الخلايا التائية من نوع الفئران البرية وتفعيلها مع anti-CD3/anti-CD28 في وجود أو عدم وجود 100-200 نانومتر جميع : Figure1. -- العابر حمض الريتينويك (RA). بعد 4-5 أيام RA - تعامل الخلايا التائية الحصول على التعبير من المستقبلات صاروخ موجه والأمعاء CCR9 a4b7. بعد ذلك ، وصفت تفاضليا الأمعاء ، والسيطرة مدار الخلايا التائية مع CFSE أو CMTMR ، وغسلها ، مختلطة في نسبة 1:1 وحقنها ماوس المتلقي عن طريق الوريد الذيل. وتستخدم بعض الخلايا المسمى لتحديد نسبة مساهمة CFSE / CMTMR (يجب أن تكون قريبة إلى 1).

تحليل الفئران مثال لتحليل صاروخ موجه يتم الحصول على الخلايا التائية 12-18 ساعة بعد الحقن وتعليق خلية واحدة من الهيئات ذات الاهتمام : Figure2. هي ملطخة الخلايا المضادة للThy1.2 (علامة مسانج) ، بالإضافة إلى مكافحة CD8 وثم Thy1.2 CD8 ^{+ +} ويتم تحليل الخلايا التائية لنسبة CMTMR ⁺ و ⁺ CFSE الخلايا في كل الأنسجة التي FACS. ثم يتم تطبيع النسيج CMTMR / CFSE نسب من نسبة CMTMR / CFSE الإدخال للحصول على الأرقام القياسية لصاروخ موجه (مرحبا). في هذا المثال CMTMR ^{+ +} وCFSE الخلايا الأمعاء مدار - T والخلايا التحكم المستجيب ، على التوالي.

المناقشة

على الرغم من التجارب صاروخ موجه تقديم معلومات قيمة للغاية حول هجرة السكان الكلي في أي خلية نسيج معين ، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن هذه المقايسات لا نحلل مباشرة الالتصاق البطانية وبالتالي فهي لا تميز فيها الخطوة (ق) من الالتصاق متعددة الخطوات شلال (الربط / المتداول ، أو تفعيل العالقة) ومستقبلات معينة صاروخ موجه يتصرف. معيار الذهب لتحديد دور محدد من المستقبلات صاروخ موجه في تتالي التصاق intravital المجهري (IVM) ، والذي لوحظ مباشرة الفردية الخلايا التائية fluorescently المسمى (أو ال...

المواد

الحيوانات : تستخدم عادة C57BL / 6 الفئران لعزل الخلايا التائية. بالإضافة إلى ذلك ، وCD45.1 Thy1.1 سلالات مسانج متاحة من خلال مختبرات جاكسون (بار هاربور ، ME).

الثقافة وسائل الإعلام : IMDM (متوسطة Iscove في التعديل Dulbecco ل+ L - الجلوتامين + Hepes) ، بالإضافة إلى 10 ٪ للحرارة المعطل FBS (الأبقار مصل الجنين ، الذيفان الداخلي منخفضة ، Gibco ® ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) استكملت مع 100 U / البنسلين مل ، 100 ملغ / مل الستربتوميسين (المضادات الحيوية HyClone ، التايم ، ماجستير) ، و 0.5 ملغ / مل fungizone / الأمفوتريسين B (Gibco) ، و 50 ملي ب - المركابتويثانول.

ACK خلايا الدم الحمراء العازلة تحلل (RBC ، 10 ملي KHCO ₃ ، 150 مم NH ₄ CL ، EDTA 0.1 ملم ، ودرجة الحموضة 8.0) ، وضبط درجة الحموضة إلى 7،2-7،4 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة).

PBS (الفوسفات التخزين المؤقت المالحة ، Hyclone ، التايم ، ماجستير).

التدفق الخلوي (FACS) وسائل الاعلام (PBS أو IMDM + 2 + 5 ٪ FBS ملي EDTA). عندما تلطيخ باستخدام Selectin - FC الوهم وسائل الاعلام مع CA مم 2 ^{+ +} ينبغي استخدامها في جميع الخطوات (بما في ذلك حيازة FACS). ينصح IMDM في هذه القضية.

تي وسم الخلية ونقل بالتبني : CFSE (carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات ، succinimidyl استر) ، CMTMR ((5 -- (و- 6 - 4)-((( كلوروميثيل) بيروكسايد) الأمينية) tetramethylrhodamine) من المسابر الجزيئية ® ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ). وينبغي بذل 1000 x في مخزونات DMSO (5 CFSE ملم ، 20 ملم CMTMR) وتخزينها في -20 درجة مئوية.

النسائل المتعددة تنشيط الخلايا T : 24 أو 96 بشكل جيد جيدا لوحات (الأنسجة ثقافة المعالجة ، والبوليسترين ، مسطحة القاع مع غطاء ، BD فالكون ، فرانكلين البحيرات ، ونيو جيرسي) هي المحتضنة لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية مع 50 مل من برنامج تلفزيوني ، على التوالي تتضمن مكافحة CD3 زائد المضادة للأضداد CD28 (10 ملغ / مل لكل منهما). ثم ، يتم غسلها لوحات ثقافة مرتين مع برنامج تلفزيوني واستخدامها على الفور للثقافة الخلايا التائية. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Dynabeads المغلفة مع anti-CD3/anti-CD28 (Dynal ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) لتنشيط خلايا تي بدلا من لوحة متجهة الأضداد.

التدفق الخلوي (FACS) تلطيخ : تفعيل النسائل المتعددة : CD3 (1452C11) ، CD28 (37.51). نسب MAB : CD4 (L3T4) ، CD8a (لي - 2) ، Thy1.2 (CD90.2/53-1.2) ، CD45.2 (104). القناة الهضمية ، صاروخ موجه المستقبلات : تنقية CCR9 (CD199/eBioCW-1.2 ، eBioscience ، سان دييغو ، كاليفورنيا) ، a4b7 (LPAM-1/DATK3) ، والسيطرة isotype (IgG2a ، ك). صاروخ موجه مستقبلات الجلد : P - selectin - FC (منقى ماوس ف Selectin -- مفتش البروتين الانصهار ، Pharmingen دينار بحريني ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) ، E - selectin FC - (المؤتلف E-Selectin/Fc ماوس الوهم ، R & D أنظمة ، مينيابوليس ، MN) ، بالإضافة إلى المقابلة الماعز كاشف F الثانوية (أ ب ') 2 المضادة للمفتش الإنسان R - PE (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا).

هو معلق جميع العابر حمض الريتينويك (سيغما ، وسانت لويس ، MO) في الإيثانول المطلق أو DMSO باستخدام لمبة صفراء أو مصدر غير مباشر للضوء أثناء التحضير. aliquots تخزينها في قارورة زجاجية في -80 درجة مئوية ، ومحمية من الضوء في جميع الأوقات. RAR الاصطناعية ناهضات : Am80 (اكو كيماويات ، ريتشموند ، فيرجينيا).