تجارب صاروخ موجه تنافسية تسمح لتقييم الخصائص الكثيرة مباشرة من اثنين من السكان مختلفة من الخلايا في ماوس واحدة. نحن هنا لتوضيح هذا الإجراء من خلال مقارنة الهجرة من خارج الحي ولدت مدار - الأمعاء مقابل عدم الأمعاء مدار الخلايا التائية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الزاجل فحوصات تنافسية لدراسة غوت - مدار هجرة الخلايا التائية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
من أجل ممارسة وظيفتها اللمفاويات الحاجة إلى مغادرة الدم وتهاجر إلى الأنسجة المختلفة في الجسم. التصاق الخلايا اللمفاوية لخلايا بطانة الأوعية الدموية والأنسجة التسرب هو عملية متعددة الخطوات التي تسيطر عليها التصاق جزيئات مختلفة (صاروخ موجه المستقبلات) في الخلايا الليمفاوية وأعرب كل منهما يغاندس (addressins) المعروضة على الخلايا البطانية 1 2. على الرغم من يمكن أن تكون وظيفة هذه المستقبلات التصاق درس جزئيا خارج الحي ، والاختبار النهائي لأهميتها الفسيولوجية هو تقييم دورها في خلال التصاق الخلايا اللمفاوية فيفو والهجرة. وقد استخدمت استراتيجيتين تكميلية لهذا الغرض : intravital المجهري (IVM) ، وتجارب صاروخ موجه. على الرغم من IVM كانت ضرورية لتحديد دقيق للمساهمة مستقبلات الالتصاق محددة خلال تتالي التصاق في الوقت الحقيقي والأنسجة المختلفة ، IVM تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة ، فإنه غالبا ما يتطلب تطوير تقنيات جراحية متطورة ، فإنها بحاجة إلى العزلة من قبل متجانسة السكان الخلية ويسمح تحليل واحد فقط الجهاز / الأنسجة في أي وقت من الأوقات. على النقيض من ذلك ، والتجارب صاروخ موجه تنافسية تسمح المقارنة المباشرة والفورية في الهجرة من اثنين (أو أكثر) مجموعات فرعية خلية في الماوس نفسه ، وأنها تسمح أيضا تحليل العديد من الأنسجة وعدد كبير من الخلايا في التجربة نفسها.
نحن هنا وصف الكلاسيكية بروتوكول صاروخ موجه تنافسية استخدمت لتحديد ميزة / الحرمان من نوع الخلية بالنظر إلى المنزل لأنسجة معينة بالمقارنة مع التحكم في عدد السكان الخلية. اخترنا لتوضيح خصائص المهاجرة مدار - الأمعاء الأمعاء ، مقابل عدم مدار الخلايا التائية ، وذلك لأن الغشاء المخاطي المعوي هو السطح أكبر هيئة في اتصال مع البيئة الخارجية وأنه هو أيضا من خارج النسيج اللمفاوي أفضل مع متطلبات محددة المهاجرة . وعلاوة على ذلك ، فقد قرر العمل مؤخرا بأن فيتامين (أ) المستقلب جميع العابر حمض الريتينويك (RA) هي الآلية الرئيسية الجزيئية المسؤولة عن التصاق الأمعاء تحريض مستقبلات محددة (إنتغرين مستقبلات chemokine a4b7and CCR9) في الخلايا الليمفاوية. وبالتالي ، فإننا قادرون على توليد بسهولة أعداد كبيرة من فيفو السابقين الأمعاء ، وغير مدار الأمعاء ، عن طريق تنشيط الخلايا الليمفاوية مدار خلايا تي في وجود أو عدم وجود التهاب المفاصل الروماتويدي ، على التوالي ، والتي يمكن استخدامها أخيرا في التجارب صاروخ موجه التنافسية الموصوفة هنا.
البروتوكول
1. فيفو الجيل السابق من الخلايا T - هومينغ الأمعاء والسيطرة (انظر الشكل 1)
- عزل splenocytes بواسطة يهرس one الطحال نوع من الفئران البرية. Resuspend تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 "في غرام × 400 إزالة طاف وليز خلايا الدم الحمراء عن طريق إعادة التعليق على بيليه خلية في 4 مل من تحلل ACK العازلة لمدة 2-3 دقائق. بعد ذلك ، أضف 5 مل من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 "في 400 XG وإزالة طاف.
- Resuspend splenocytes إجمالي 1 × 10 6 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من التجارب صاروخ موجه تقديم معلومات قيمة للغاية حول هجرة السكان الكلي في أي خلية نسيج معين ، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن هذه المقايسات لا نحلل مباشرة الالتصاق البطانية وبالتالي فهي لا تميز فيها الخطوة (ق) من الالتصاق متعددة الخطوات شلال (الربط / المتداول ، أو تفعيل العالقة) ومستقبلات معينة صاروخ موجه يتصرف. معيار الذهب لتحديد دور محدد من المستقبلات صاروخ موجه في تتالي التصاق intravital المجهري (IVM) ، والذي لوحظ مباشرة الفردية الخلايا التائية fluorescently المسمى (أو ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
معتمد من قبل EJV الزمالة من مؤسسة ستاندرد اند كرون التهاب القولون الأمريكية (CCFA). ويدعم JRM من المنح المقدمة من CCFA ، معهد بحوث السرطان (كوستاريكا) ، هوارد H. غودمان (MGH) ، ماساشوستس مركز علوم الحياة (MLSC) وجائزة مدير معاهد الصحة القومية ليالي مبتكر جديد.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
الحيوانات : تستخدم عادة C57BL / 6 الفئران لعزل الخلايا التائية. بالإضافة إلى ذلك ، وCD45.1 Thy1.1 سلالات مسانج متاحة من خلال مختبرات جاكسون (بار هاربور ، ME).
الثقافة وسائل الإعلام : IMDM (متوسطة Iscove في التعديل Dulbecco ل+ L - الجلوتامين + Hepes) ، بالإضافة إلى 10 ٪ للحرارة المعطل FBS (الأبقار مصل الجنين ، الذيفان الداخلي منخفضة ، Gibco ® ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) استكملت مع 100 U / البنسلين مل ، 100 ملغ / مل الستربتوميسين (المضادات الحيوية HyClone ، التايم ، ماجستير) ، و 0.5 ملغ / مل fungizone / الأمفوتريسين B (Gibco) ، و 50 ملي ب - المركابتويثانول.
ACK خلايا الدم الحمراء العازلة تحلل (RBC ، 10 ملي KHCO 3 ، 150 مم NH 4 CL ، EDTA 0.1 ملم ، ودرجة الحموضة 8.0) ، وضبط درجة الحموضة إلى 7،2-7،4 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة).
PBS (الفوسفات التخزين المؤقت المالحة ، Hyclone ، التايم ، ماجستير).
التدفق الخلوي (FACS) وسائل الاعلام (PBS أو IMDM + 2 + 5 ٪ FBS ملي EDTA). عندما تلطيخ باستخدام Selectin - FC الوهم وسائل الاعلام مع CA مم 2 + + ينبغي استخدامها في جميع الخطوات (بما في ذلك حيازة FACS). ينصح IMDM في هذه القضية.
تي وسم الخلية ونقل بالتبني : CFSE (carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات ، succinimidyl استر) ، CMTMR ((5 -- (و- 6 - 4)-((( كلوروميثيل) بيروكسايد) الأمينية) tetramethylrhodamine) من المسابر الجزيئية ® ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ). وينبغي بذل 1000 x في مخزونات DMSO (5 CFSE ملم ، 20 ملم CMTMR) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
النسائل المتعددة تنشيط الخلايا T : 24 أو 96 بشكل جيد جيدا لوحات (الأنسجة ثقافة المعالجة ، والبوليسترين ، مسطحة القاع مع غطاء ، BD فالكون ، فرانكلين البحيرات ، ونيو جيرسي) هي المحتضنة لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية مع 50 مل من برنامج تلفزيوني ، على التوالي تتضمن مكافحة CD3 زائد المضادة للأضداد CD28 (10 ملغ / مل لكل منهما). ثم ، يتم غسلها لوحات ثقافة مرتين مع برنامج تلفزيوني واستخدامها على الفور للثقافة الخلايا التائية. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Dynabeads المغلفة مع anti-CD3/anti-CD28 (Dynal ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) لتنشيط خلايا تي بدلا من لوحة متجهة الأضداد.
التدفق الخلوي (FACS) تلطيخ : تفعيل النسائل المتعددة : CD3 (1452C11) ، CD28 (37.51). نسب MAB : CD4 (L3T4) ، CD8a (لي - 2) ، Thy1.2 (CD90.2/53-1.2) ، CD45.2 (104). القناة الهضمية ، صاروخ موجه المستقبلات : تنقية CCR9 (CD199/eBioCW-1.2 ، eBioscience ، سان دييغو ، كاليفورنيا) ، a4b7 (LPAM-1/DATK3) ، والسيطرة isotype (IgG2a ، ك). صاروخ موجه مستقبلات الجلد : P - selectin - FC (منقى ماوس ف Selectin -- مفتش البروتين الانصهار ، Pharmingen دينار بحريني ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) ، E - selectin FC - (المؤتلف E-Selectin/Fc ماوس الوهم ، R & D أنظمة ، مينيابوليس ، MN) ، بالإضافة إلى المقابلة الماعز كاشف F الثانوية (أ ب ') 2 المضادة للمفتش الإنسان R - PE (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا).
هو معلق جميع العابر حمض الريتينويك (سيغما ، وسانت لويس ، MO) في الإيثانول المطلق أو DMSO باستخدام لمبة صفراء أو مصدر غير مباشر للضوء أثناء التحضير. aliquots تخزينها في قارورة زجاجية في -80 درجة مئوية ، ومحمية من الضوء في جميع الأوقات. RAR الاصطناعية ناهضات : Am80 (اكو كيماويات ، ريتشموند ، فيرجينيا).
المراجع
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradi....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
