كله يشن التحليل المناعى للالجنينية الاطراف الأوعية الدموية الجلدية : نظام نموذجي لدراسة الأوعية الدموية المتفرعة التشكل في الأجنة

ملخص

نقدم تقنية الكيمياء النسيجية المناعية للعينة الكاملة والمجهر البؤري الماسح بالليزر مع الوسم المتعدد لتحليل تكوين الشبكة الوعائية المعقدة في جلد أطراف الأجنة للفئران.

الملخص

يعد التحليل الكيميائي النسيجي المناعي للعينة الكاملة (Whole-mount) لتصوير الشبكة الوعائية بأكملها أمرًا محوريًا لفهم الآليات الخلوية للتخلق التشعبي. لقد طورنا نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة التطور الوعائي، حيث يتم إعادة تنظيم ضفيرة شعيرية بدائية موجودة مسبقًا إلى شبكة وعائية متفرعة هرميًا. ويسمح المجهر البؤري (confocal microscopy) للعينة الكاملة مع الوسم المتعدد بإجراء تصوير قوي للأوعية الدموية السليمة ومكوناتها الخلوية، بما في ذلك الخلايا البطانية، والخلايا الحولية، وخلايا العضلات الملساء، باستخدام علامات فلورية محددة. وقد أدت التطورات في نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف مع الدراسات الجينية إلى تحسين فهم الآليات الجزيئية للتطور والنمط الوعائي. كما استُخدم نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة كيفية توفير الأعصاب الطرفية لقالب مكاني لتمايز وتنميط الشرايين. تصف هذه المقالة المرئية بروتوكولاً بسيطاً وقوياً لصبغ الأوعية الدموية السليمة باستخدام أجسام مضادة متخصصة بالأوعية وأجسام مضادة ثانوية فلورية، وهو بروتوكول قابل للتطبيق على الأعضاء الجنينية ذات التروية الوعائية حيث يمكننا تتبع عملية التطور الوعائي.

البروتوكول

1. جمع جلد الطرف الجنيني للفأر (E13.5~E17.5)

1. يتم القتل الرحيم للإناث التي تم تزاوجها (plugged females) وفقاً للإجراء المعتمد. وبناءً على بروتوكول الحيوانات المعتمد لدينا، يتم القتل الرحيم للإناث عن طريق التعرض لـ CO₂ ثم التأكد من ذلك عن طريق الخلع العنقي. يوضع الحيوان على منشفة ورقية ممتصة ويغمر جيداً في 70% EtOH/H₂O باستخدام زجاجة ضاغطة.
2. يتم تشريح الرحم وهو سليم ووضعه في طبق بيتري مقاس 10 × 15 مم يحتوي على محلول هانكس الملح المتوازن (HBSS) المبرد بالثلج لغسل الدم.
3. يتم فصل وتشريح الجنين. يتم إزالة الغشاء السلوى (amnion) الرقيق جداً من الجنين.
4. (اختياري) يتم تشريح جنين واحد في طبق بيتري مقاس 35 × 10 مم إذا كانت هناك حاجة لتحديد النمط الجيني لكل جنين. ينقل الذيل الذي تم تشريحه إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مل لتحديد النمط الجيني.
5. يتم قطع الأطراف الأمامية للجنين ونقلها بواسطة ملقط حلقي إلى طبق 24 بئراً يحتوي على 2 مل من مادة بارافورمالدهيد (PFA) بتركيز 4% طازجة ومبردة بالثلج في محلول منظم فوسفاتي ملحي (PBS).
6. تثبت الأطراف الأمامية مع الخلط اللطيف على جهاز Nutator Mixer عند درجة حرارة 4°C طوال الليل.
7. في اليوم التالي، يتم إزالة PFA والغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في 2 مل من PBS مع الخلط اللطيف على جهاز Nutator Mixer في درجة حرارة الغرفة.
8. تنقل الأطراف الأمامية إلى ميثانول (MeOH) بتركيز 10% وتخزن في مجمد الإنزيمات عند درجة حرارة -20°C (المجمد المزود بنظام تحكم دقيق في درجة الحرارة وبدون خاصية إذابة الثلج التلقائية). تعمل الأجسام المضادة الأولية المدرجة في الجدول 1 بعد المعالجة بـ 100% MeOH.
9. يتم نزع الجلد من الطرف الأمامي باستخدام ملاقط دقيقة. عند تجفيف جلد الطرف، يجب أن ينفصل بسهولة عن الطرف. أولاً، يوضع الطرف بحيث يكون الجانب البطني (جانب الراحة) موجهاً للأعلى. ثم باستخدام ملاقط دقيقة، يتم قطع الجلد كما هو موضح في الفيديو. بعد ذلك يتم التشريح حول الطرف بالكامل، ونزع الجلد بلطف دون التسبب في أي ضرر.

2. الصبغ المناعي الكيميائي النسيجي للعينات الكاملة من جلود الأطراف

1. أعد ترطيب جلود الأطراف في أنبوب بولي بروبيلين دائري القاع سعة 5ml عن طريق التحضين عبر سلسلة متدرجة من MeOH/PBT (PBS + 0.2%Triton X-10) بنسب (75%، 50%، 25%) لمدة 5 min لكل منها. لاحظ وجوب توخي الحذر عند تبديل المحاليل لتجنب إتلاف جلود الأطراف.
2. اغسل الجلد مرتين لمدة 5 min في PBT مع الخلط اللطيف باستخدام Nutator Mixer في درجة حرارة الغرفة.
3. قم بحجب جلود الأطراف إما باستخدام محلول حجب مكون من 10%Goat serum/PBS+0.2%TX10 للأجسام المضادة الثانوية الماعزية، أو محلول حجب مكون من 10%Donkey serum/PBS+0.2%TX10 للأجسام المضادة الثانوية الحميرية، لمدة ساعتين مع الخلط اللطيف باستخدام Nutator Mixer في درجة حرارة الغرفة.
4. ضع جلود الأطراف في طبق Petri dish مقاس 35 × 10 mm، وانقلها باستخدام ملقط حلقي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2ml يحتوي على 80μl من الأجسام المضادة الأولية (بالتخفيف المناسب كما هو مدرج في الجداول) في محلول الحجب (إما 10%Goat serum/PBS+0.2%TX10 أو 10%Donkey serum/PBS+0.2%TX10). حضّن جلود الأطراف مع الخلط اللطيف باستخدام Nutator Mixer عند 4°C طوال الليل. لاحظ إمكانية استخدام أجسام مضادة أولية متعددة مشتقة من أنواع مختلفة (مثل: جسم مضاد أحادي النسيلة من الجرذ + جسم مضاد متعدد النسائل من الأرنب) في آن واحد.
5. في اليوم التالي، ضع جلود الأطراف في طبق Petri dish مقاس 35 × 10 mm وانقلها باستخدام ملقط حلقي إلى أنبوب بولي بروبيلين دائري القاع سعة 5ml يحتوي على 4ml من محلول الغسيل (إما 2%Goat serum/PBS+0.2%TX10 أو 2%Donkey serum/PBS+0.2%TX10).
6. اغسل الجلد خمس مرات لمدة 15 min مع الخلط اللطيف باستخدام Nutator Mixer في درجة حرارة الغرفة.
7. ضع جلود الأطراف في طبق Petri dish مقاس 35 × 10 mm وانقلها باستخدام ملقط حلقي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2ml يحتوي على 80μl من الأجسام المضادة الثانوية في محلول الحجب (إما 10%Goat serum/PBS+0.2%TX10 أو 10%Donkey serum/PBS+0.2%TX10). عادةً ما نستخدم أجسامًا مضادة ثانوية من شركة Jackson ImmunoResearch (بتركيزات Cy3 وCy5، وتخفيف 1:30) أو شركة Invitrogen (بتركيزات Alexa Fluor 48 وAlexa Fluor 568 وAlexa Fluor 63، وتخفيف 1:250). قم بترشيح محلول الجسم المضاد الثانوي باستخدام مرشحات حقنة من غشاء PVDF بمسامية 0.2μm لإزالة الجسيمات المتكتلة من الأجسام المضادة الثانوية. حضّن جلود الأطراف في الظلام أو مغلفة برقائق الألومنيوم لمدة ساعة واحدة مع الخلط اللطيف باستخدام Nutator Mixer في درجة حرارة الغرفة. لاحظ إمكانية استخدام أجسام مضادة ثانوية مقترنة بفلوروفورات مختلفة ومشتقة من أنواع مختلفة في آن واحد.
8. ضع جلود الأطراف في طبق Petri dish مقاس 35 × 10 mm وانقلها باستخدام ملقط حلقي إلى أنبوب بولي بروبيلين دائري القاع سعة 5ml يحتوي على 4ml من محلول الغسيل (إما 2%Goat serum/PBS+0.2%TX10 أو 2%Donkey serum/PBS+0.2%TX100). اغسل الجلد خمس مرات لمدة 15 min في الظلام أو مغلفاً برقائق الألومنيوم مع الخلط اللطيف باستخدام Nutator Mixer في درجة حرارة الغرفة.
9. (خيار الصبغات المضادة للنواة) حضّن جلود الأطراف مع 4ml من محلول الغسيل (إما 2%Goat serum/PBS+0.2%TX10 أو 2%Donkey serum/PBS+0.2%TX10) مع To-Pro-3 (Invitrogen T3605، تخفيف 1:300) في الظلام أو مغلفة برقائق الألومنيوم لمدة 10 min مع الخلط اللطيف باستخدام Nutator Mixer في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الجلد ثلاث مرات لمدة 5 min باستخدام 4ml من محلول الغسيل (إما 2%Goat serum/PBS+0.2%TX10 أو 2%Donkey serum/PBS+0.2%TX10) في الظلام أو مغلفاً برقائق الألومنيوم مع الخلط اللطيف باستخدام Nutator Mixer في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أنه يتم رصد صبغ قوي ونوعي للنوى باستخدام To-pro-3 عند انبعاث محدد (إثارة HeNe 63 nm).

3. تثبيت جلود الأطراف على الشريحة

1. ضع جلود الأطراف في طبق بتري بمقاس 35 x 10 mm. قم بإزالة الأتربة والبلورات والألياف من الطبقة الداخلية للجلود باستخدام ملاقط دقيقة تحت المجهر المجسم مع استخدام إضاءة منخفضة لتجنب حدوث تبييض ضوئي واسع النطاق.
2. انقل جلود الأطراف إلى شريحة مجهرية لاصقة باستخدام ملقط حلقي. ضع الجلود بحيث تكون الطبقة الداخلية متجهة للأعلى على الشريحة (أي باتجاه الغطاء الزجاجي). قم بتسطيح الجلود بعناية باستخدام ملاقط دقيقة وأزل بقايا محلول الغسيل باستخدام Kimwipe.
3. قم بالتثبيت في وسط تثبيت مانع للتلاشي دون وجود فقاعات هوائية. نستخدم غطاءً زجاجياً بمقاس 25"x25". اترك العينات لتجف على سطح مستوٍ في الظلام (على سبيل المثال، توضع العينات المثبتة باستخدام كاشف ProLong Gold طوال الليل في الظلام في درجة حرارة الغرفة قبل الفحص). للتخزين طويل الأمد، قم بإحكام غلق الغطاء الزجاجي على الشريحة وتخزينها عند 4°C.

4. المجهر البؤري

1. قم بإعداد الليزرات المناسبة للفلوروفورات. نحن نستخدم مجهر كونفوكال Leica TCS SP5 بثلاثة مصادر ليزر تشمل Argon 488nm (لـ Alexa Fluor 48 و GFP)، و DPSS 561nm (لـ Alexa Fluor 568 و Cy3)، و HeNe 63nm (لـ Alexa Fluor 63 و Cy5 و To-Pro-3).
2. استخدم أداة المسح المتسلسل (sequential scan) لتجنب أو تقليل التداخل (crosstalk) الذي يحدث عند إثارة جميع الصبغات في العينات المصبوغة ثنائياً أو ثلاثياً في آن واحد. في وضع المسح المتسلسل، سيتم تسجيل الصور بترتيب تتابعي.
3. يمكن العثور على معلومات أكثر عمومية حول الصبغات الفلورية وليزرات الإثارة في كتاب "Confocal Microscopy for Biologists" للمؤلف Hibbs (2004).

5. نتائج نموذجية

كشف مجهر الفلورة المناعية متحد البؤر ثلاثي الوسوم للعينة الكاملة في جلد الطرف الأمامي للفأر في المرحلة الجنينية E15.5، باستخدام أجسام مضادة لعلامة الخلايا البطانية الشاملة PECAM-1 (الشكل 1A-C، وD باللون الأزرق)، وعلامة الخيوط العصبية 2H3 (الشكل 1A باللون الأخضر)، وعلامة خلايا العضلات الملساء αSMA (الشكل 1A، B باللون الأحمر)، عن نمط تفرع مميز للشرايين αSMA⁺، والتي تصطف مع الأعصاب الطرفية 2H3⁺ في جلد الطرف. وبالإضافة إلى تفرع الأوعية الدموية، يُستخدم نموذج الأوعية الدموية في جلد الطرف هذا لدراسة نمط تفرع الأوعية اللمفاوية باستخدام أجسام مضادة لعلامة الخلايا البطانية اللمفاوية LYVE-1 (الشكل 1D، E باللون الأحمر) وNeuropilin2 (NRP2) (الشكل 1D، F باللون الأخضر).

الشكل 1. (أ-ج) تتماشى الشرايين مع الأعصاب الطرفية في جلد الطرف الجنيني. يُظهر الشكل مجهر الفلورة المناعية البؤري ثلاثي الوسم للعينة الكاملة باستخدام أجسام مضادة لعلامة الخلايا البطانية الشاملة PECAM-1 (أ-ج، باللون الأزرق)، وعلامة الخيوط العصبية 2H3 (أ، باللون الأخضر)، وعلامة خلايا العضلات الملساء αSMA (أ وب، باللون الأحمر). في اليوم الجنيني E15.5، تظهر 2H3⁺ ترتبط الأعصاب الطرفية (الأسهم المفتوحة) بالشرايين (رؤوس الأسهم) المغطاة بـ αSMA⁺ خلايا العضلات الملساء. (D-F) الأوعية اللمفاوية في جلد الطرف الجنيني. يُظهر الشكل مجهر الفلورة المناعية البؤري ثلاثي الوسم باستخدام أجسام مضادة لعلامة الخلايا البطانية الشاملة PECAM-1 (D، باللون الأزرق)، وعلامة الخلايا البطانية اللمفاوية LYVE-1 (D و E، باللون الأحمر)، وNeuropilin2 (NRP2) (D و F، باللون الأخضر). تظهر الأوعية اللمفاوية من خلال كل من LYVE-1 و NRP2، بينما يُعبر أيضًا عن LYVE-1 في مجموعة فرعية من البلاعم (رؤوس السهام المفتوحة). شريط المقياس: 100μm.

المناقشة

يعتبر الجهاز الوعائي حيويًا لتطور الأعضاء أثناء التخلق الجنيني، وكذلك لصيانة الأعضاء والوظائف التناسلية لدى البالغين، لأنه يمد الأعضاء بالأكسجين والعناصر الغذائية الكافية. وتتشكل الشبكة الوعائية السليمة من خلال عمليات معقدة ومتعددة الخطوات عبر تكوين الأوعية الدموية (angiogenesis)، حيث يتم إعادة تنظيم شبكة الشعيرات الدموية الموجودة مسبقًا إلى هياكل هرمية وعالية التفرع. وعلى الرغم من أن العديد من الدراسات أظهرت مشاركة مجموعة متنوعة من الجزيئات في هذه العمليات، إلا أنه لم يتضح بعد كيف توفر الأعضاء أو مكوناتها الإشارات التي ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الأجسام المضادة واسم عام للخلايا البطانية <حدود الجدول="1">
جسم مضاد	الأنواع	الشركة	رقم الكتالوج #	ظروف العمل
PECAM-1	هامستر أرمني (ذكر)	Chemicon	MAB1398Z	تخفيف بنسبة 1:100#1
PECAM-1	جرذ (ذكر)	BD	553369	تخفيف بنسبة 1:300
VEGFR2	جرذ (ذكر)	eBioscience	14-5821-82	تخفيف بنسبة 1:200
CD34	جرذ (ذكر)	eBioscience	13-0341	تخفيف بنسبة 1:300
كولاجين IV	أرنب (P)	AbD Serotec	2150-1470	تخفيف بنسبة 1:300#2

مؤشر الخلايا البطانية الشريانية

<حدود الجدول="1"> الأجسام المضادة الأنواع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل نيوروبيلين 1 أرنب (P) أليكس كولودكين’مختبر^#3 تخفيف بنسبة 1:3000 Unc5H2 ماعز (P) R&D AF1006 تخفيف بنسبة 1:200

مؤشر الخلايا البطانية الوريدية

<حدود الجدول="1"> جسم مضاد النوع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل EphB4 ماعز (P) R&D AF446 تخفيف بنسبة 1:100

مؤشر الخلايا البطانية اللمفاوية

<حدود الجدول="1"> جسم مضاد الأنواع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل LYVE-1^#4 أرنب (P) Abcam ab14917 تخفيف بنسبة 1:200 LYVE-1^#4 جرذ (ذكر) مُستقبل مانهوليكتيد (MBL) D225-3 تخفيف بنسبة 1:200 Prox-1 أرنب (P) Chemicon AB5475 تخفيف بنسبة 1:1000 Prox-1 ماعز (P) يُعد تحليل الكيمياء النسيجية المناعية للعينة الكاملة (Whole-mount immunohistochemical analysis) لتصوير الأوعية الدموية بأكملها أمراً محورياً لفهم الآليات الخلوية للتخلق التشعبي. لقد طورنا نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة التطور الوعائي، حيث يتم إعادة تنظيم ضفيرة شعيرية بدائية موجودة مسبقاً إلى شبكة وعائية متفرعة هرمياً. ويسمح المجهر البؤري للعينة الكاملة (Whole-mount confocal microscopy) مع الوسم المتعدد بتصوير قوي للأوعية الدموية السليمة ومكوناتها الخلوية، بما في ذلك الخلايا البطانية، والخلايا الحولية، وخلايا العضلات الملساء، باستخدام علامات فلورية محددة. وقد أدت التطورات في نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف، بالتزامن مع الدراسات الجينية، إلى تحسين فهم الآليات الجزيئية للتطور الوعائي وتشكيله. كما استُخدم نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة كيف توفر الأعصاب الطرفية قالباً مكانياً لتمايز الشرايين وتشكيلها. يصف هذا المقال المرئي بروتوكولاً بسيطاً وقوياً لصبغ الأوعية الدموية السليمة باستخدام أجسام مضادة متخصصة بالأوعية وأجسام مضادة ثانوية فلورية، وهو بروتوكول قابل للتطبيق على الأعضاء الجنينية الموعاة حيث يمكننا تتبع عملية التطور الوعائي.&D AF2727 تخفيف بنسبة 1:50 نيوروبيلين 2 أرنب (P) تأشير الخلايا 3366 تخفيف بنسبة 1:100 بودوبلانين هامستر سوري (ذكر) بنك الهجينات (Hybridoma Bank) 8.1.1 تخفيف بنسبة 1:200

مؤشر الخلايا العضلية الملساء/الخلايا الحولية

<حدود الجدول="1"> جسم مضاد النوع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل αSMA-Cy3 فأر (M)^#5 سيجما c-6198 تخفيف بنسبة 1:500^#6 NG2 أرنب (P) Chemicon AB5320 تخفيف بنسبة 1:200 SM22α أرنب (P) Abcam ab14106 تخفيف بنسبة 1:200

الأجسام المضادة لـGFP مُبلِّغ

<حدود الجدول="1"> الأجسام المضادة النوع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أرنب (P) Invitrogen A11122 تخفيف بنسبة 1:300 GFP جرذ (ذكر) Nacalai tesque 04404-84 تخفيف بنسبة 1:1000 البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كتكوت (P) Chemicon P42212 تخفيف بنسبة 1:300

الأجسام المضادة لـ LacZ مراسل

<حدود الجدول="1"> جسم مضاد الأنواع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل β-gal أرنب (P) MP Biomedical 55976 تخفيف بنسبة 1:5000 βجال- (gal-) ماعز (P) AbD Serotec 4600-1409 تخفيف بنسبة 1:500 β-جال كتكوت (P) Abcam ab9361 تخفيف بنسبة 1:200

الأجسام المضادة للمحور العصبي الطرفي

<حدود الجدول="1"> جسم مضاد النوع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل 2H3 فأر (M)^#7 بنك الهجينات (Hybridoma Bank) 2H3 تخفيف بنسبة 1:200 Tuj1 فأر (M)^#8 Covance MMS-435P تخفيف بنسبة 1:500 بيريفيرين أرنب (P) Chemicon AB1530 تخفيف بنسبة 1:1000

الأجسام المضادة لخلايا شوان المهاجرة

<حدود الجدول="1"> BFABP أرنب (P) توماس إمüيبدو أن النص المصدر غير مكتمل ("ller")؛ يرجى تزويد النص الكامل المراد ترجمته.’مختبر^#9 تخفيف بنسبة 1:3000

(P): جسم مضاد متعدد النسائل، (M): جسم مضاد أحادي النسيلة

#1: يجب استخدام الجسم المضاد Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (من شركة Jackson ImmunoResearch، رقم 127-165-160) كجسم مضاد ثانوي.

<يعد التحليل الكيميائي النسيجي المناعي للعينة الكاملة (Whole-mount immunohistochemical analysis) لتصوير الشبكة الوعائية بأكملها أمراً محورياً لفهم الآليات الخلوية للتخلق التفرعي. لقد طورنا نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة التطور الوعائي، حيث يتم في هذا النموذج إعادة تنظيم ضفيرة شعيرية بدائية موجودة مسبقاً إلى شبكة وعائية متفرعة هرمياً. ويسمح المجهر البؤري للعينة الكاملة (Whole-mount confocal microscopy) مع التوسيم المتعدد بإجراء تصوير دقيق للأوعية الدموية السليمة وكذلك مكوناتها الخلوية، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا الحولية وخلايا العضلات الملساء، باستخدام واسمات فلورية محددة. وقد أدت التطورات في نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف، بالتزامن مع الدراسات الجينية، إلى تحسين فهم الآليات الجزيئية للتطور الوعائي وتشكيله. كما استُخدم نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة كيف توفر الأعصاب الطرفية قالباً مكانياً لتمايز الشرايين وتشكيلها. يصف هذا المقال المرئي بروتوكولاً بسيطاً ودقيقاً لصبغ الأوعية الدموية السليمة باستخدام أجسام مضادة متخصصة بالأوعية وأجسام مضادة ثانوية فلورية، وهو بروتوكول قابل للتطبيق على الأعضاء الجنينية ذات التروية الدموية حيث يمكننا تتبع عملية التطور الوعائي."يعد التحليل الكيميائي النسيجي المناعي للعينة الكاملة (Whole-mount immunohistochemical analysis) لتصوير الأوعية الدموية بأكملها أمرًا محوريًا لفهم الآليات الخلوية للتخلق التشعبي. لقد قمنا بتطوير نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة التطور الوعائي، حيث يتم إعادة تنظيم ضفيرة شعيرية بدائية موجودة مسبقًا لتتحول إلى شبكة وعائية متفرعة هرميًا. ويسمح المجهر البؤري (confocal microscopy) للعينة الكاملة مع التوسيم المتعدد بتصوير قوي للأوعية الدموية السليمة ومكوناتها الخلوية، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا الحولية وخلايا العضلات الملساء، باستخدام علامات فلورية محددة. وقد أدى التقدم في نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف، بالتزامن مع الدراسات الجينية، إلى تحسين فهم الآليات الجزيئية للتطور الوعائي وتشكيله. كما استُخدم نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة كيفية توفير الأعصاب الطرفية لقالب مكاني لتمايز الشرايين وتشكيلها. يصف هذا المقال المرئي بروتوكولًا بسيطًا وقويًا لصبغ الأوعية الدموية السليمة باستخدام أجسام مضادة متخصصة بالأوعية وأجسام مضادة ثانوية فلورية، وهو بروتوكول قابل للتطبيق على الأعضاء الجنينية ذات التروية الوعائية حيث يمكننا تتبع عملية التطور الوعائي.">#2: يمكن استخدام جسم المضاد للكولاجين IV (Collagen IV antibody) للكشف عن الأوعية الدموية بعد في الموقع التهجين.

<يبدو أن النص المصدر غير مكتمل (يتكون فقط من وسم HTML "p class="). يرجى تزويدي بالنص العلمي الكامل المراد ترجمته."يعد التحليل المناعي النسيجي الكيميائي للعينة الكاملة (Whole-mount) لتصوير الشبكة الوعائية بأكملها أمراً محورياً لفهم الآليات الخلوية لتخلق التفرع (branching morphogenesis). لقد قمنا بتطوير نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة التطور الوعائي، حيث يتم إعادة تنظيم ضفيرة شعيرية بدائية موجودة مسبقاً إلى شبكة وعائية متفرعة هرمياً. ويسمح المجهر البؤري (confocal microscopy) للعينة الكاملة مع الوسم المتعدد بتصوير قوي للأوعية الدموية السليمة، بالإضافة إلى مكوناتها الخلوية بما في ذلك الخلايا البطانية، والخلايا الحولية، وخلايا العضلات الملساء، وذلك باستخدام واسمات فلورية محددة. وقد أدت التطورات في نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف مع الدراسات الجينية إلى تحسين فهم الآليات الجزيئية للتطور الوعائي وتشكله. كما استُخدم نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة كيفية توفير الأعصاب الطرفية لقالب مكاني لتمايز الشرايين وتشكلها. يصف هذا المقال المرئي بروتوكولاً بسيطاً وقوياً لصبغ الأوعية الدموية السليمة باستخدام أجسام مضادة نوعية للأوعية وأجسام مضادة ثانوية فلورية، وهو بروتوكول قابل للتطبيق على الأعضاء الجنينية الموعاة حيث يمكننا تتبع عملية التطور الوعائي.">#3: يتكرم Alex Kolodkin بتوفير جسم مضاد Neuropilin1’مختبر في جامعة جونز هوبكنز. يتوفر الجسم المضاد لـ Neuropilin1 البشري والمستخلص من الأغنام في R&D (AF3870)، على الرغم من أننا لم نختبره بعد.

#4: تكتشف أجسام LYVE-1 المضادة أيضاً مجموعة فرعية من الخلايا البلعمية في الجلد الجنيني.

#5: الجسم المضاد المضاد لـαإن الجسم المضاد لـ SMA هو جسم مضاد أحادي النسيلة من نوع IgG2a الفأري.

#6: المرتبط بـ Cy3 αيتم تحضين جسم المضاد SMA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأجسام المضادة الأولية الأخرى.

#7: الجسم المضاد 2H3 هو جسم مضاد أحادي النسيلة من نوع mouse IgG1 مضاد للـ neurofilament.

#8: الجسم المضاد Tuj1 هو جسم مضاد أحادي النسيلة من النوع mouse IgG2a ضد بيتا-توبولين من الفئة الثالثة الخاص بالعصبونات.

#9: تبرع توماس إم (Thomas M) بلطف بالأجسام المضادة لبروتين ربط الأحماض الدهنية النوعي للدماغ (BFABP).üيبدو أن النص المصدر غير مكتمل ("ller")، يرجى تقديم النص الكامل المراد ترجمته.’مختبر في Max-Delbrüüمركز ck للطب الجزيئي.