نقدم تقنية الكيمياء النسيجية المناعية للعينة الكاملة والمجهر البؤري الماسح بالليزر مع الوسم المتعدد لتحليل تكوين الشبكة الوعائية المعقدة في جلد أطراف الأجنة للفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كله يشن التحليل المناعى للالجنينية الاطراف الأوعية الدموية الجلدية : نظام نموذجي لدراسة الأوعية الدموية المتفرعة التشكل في الأجنة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد التحليل الكيميائي النسيجي المناعي للعينة الكاملة (Whole-mount) لتصوير الشبكة الوعائية بأكملها أمرًا محوريًا لفهم الآليات الخلوية للتخلق التشعبي. لقد طورنا نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة التطور الوعائي، حيث يتم إعادة تنظيم ضفيرة شعيرية بدائية موجودة مسبقًا إلى شبكة وعائية متفرعة هرميًا. ويسمح المجهر البؤري (confocal microscopy) للعينة الكاملة مع الوسم المتعدد بإجراء تصوير قوي للأوعية الدموية السليمة ومكوناتها الخلوية، بما في ذلك الخلايا البطانية، والخلايا الحولية، وخلايا العضلات الملساء، باستخدام علامات فلورية محددة. وقد أدت التطورات في نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف مع الدراسات الجينية إلى تحسين فهم الآليات الجزيئية للتطور والنمط الوعائي. كما استُخدم نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة كيفية توفير الأعصاب الطرفية لقالب مكاني لتمايز وتنميط الشرايين. تصف هذه المقالة المرئية بروتوكولاً بسيطاً وقوياً لصبغ الأوعية الدموية السليمة باستخدام أجسام مضادة متخصصة بالأوعية وأجسام مضادة ثانوية فلورية، وهو بروتوكول قابل للتطبيق على الأعضاء الجنينية ذات التروية الوعائية حيث يمكننا تتبع عملية التطور الوعائي.
البروتوكول
1. جمع جلد الطرف الجنيني للفأر (E13.5~E17.5)
- يتم القتل الرحيم للإناث التي تم تزاوجها (plugged females) وفقاً للإجراء المعتمد. وبناءً على بروتوكول الحيوانات المعتمد لدينا، يتم القتل الرحيم للإناث عن طريق التعرض لـ CO2 ثم التأكد من ذلك عن طريق الخلع العنقي. يوضع الحيوان على منشفة ورقية ممتصة ويغمر جيداً في 70% EtOH/H2O باستخدام زجاجة ضاغطة.
- يتم تشريح الرحم وهو سليم ووضعه في طبق بيتري مقاس 10 × 15 مم يحتوي على محلول هانكس الملح المتوازن (HBSS) المبرد بالثلج لغسل الدم.
- يتم فصل وتشريح الجنين. يتم إزالة الغشاء السلوى (amnion) الرقيق جداً من الجنين.
- (اختياري) يتم تشريح جنين واحد في طبق بيتري مقاس 35 × 10 مم إذا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعتبر الجهاز الوعائي حيويًا لتطور الأعضاء أثناء التخلق الجنيني، وكذلك لصيانة الأعضاء والوظائف التناسلية لدى البالغين، لأنه يمد الأعضاء بالأكسجين والعناصر الغذائية الكافية. وتتشكل الشبكة الوعائية السليمة من خلال عمليات معقدة ومتعددة الخطوات عبر تكوين الأوعية الدموية (angiogenesis)، حيث يتم إعادة تنظيم شبكة الشعيرات الدموية الموجودة مسبقًا إلى هياكل هرمية وعالية التفرع. وعلى الرغم من أن العديد من الدراسات أظهرت مشاركة مجموعة متنوعة من الجزيئات في هذه العمليات، إلا أنه لم يتضح بعد كيف توفر الأعضاء أو مكوناتها الإشارات التي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نتوجه بالشكر إلى K. Gill للمساعدة في تربية الفئران ورعايتها ولإدارة المختبر. والشكر موجه أيضاً لأعضاء مختبر Mukoyama على المساعدة التقنية. تم تقديم التمويل من قبل برنامج الأبحاث الداخلية في المعاهد الوطنية للصحة (National Institutes of Health).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
الأجسام المضادة واسم عام للخلايا البطانية <حدود الجدول="1"> | ||||
| جسم مضاد | الأنواع | الشركة | رقم الكتالوج # | ظروف العمل |
| PECAM-1 | هامستر أرمني (ذكر) | Chemicon | MAB1398Z | تخفيف بنسبة 1:100#1 |
| PECAM-1 | جرذ (ذكر) | BD | 553369 | تخفيف بنسبة 1:300 |
| VEGFR2 | جرذ (ذكر) | eBioscience | 14-5821-82 | تخفيف بنسبة 1:200 |
| CD34 | جرذ (ذكر) | eBioscience | 13-0341 | تخفيف بنسبة 1:300 |
| كولاجين IV | أرنب (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | تخفيف بنسبة 1:300#2 |
مؤشر الخلايا البطانية الشريانية
<حدود الجدول="1"> الأجسام المضادة الأنواع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل نيوروبيلين 1 أرنب (P) أليكس كولودكين’مختبر#3 تخفيف بنسبة 1:3000 Unc5H2 ماعز (P) R&D AF1006 تخفيف بنسبة 1:200مؤشر الخلايا البطانية الوريدية
<حدود الجدول="1"> جسم مضاد النوع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل EphB4 ماعز (P) R&D AF446 تخفيف بنسبة 1:100مؤشر الخلايا البطانية اللمفاوية
<حدود الجدول="1"> جسم مضاد الأنواع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل LYVE-1#4 أرنب (P) Abcam ab14917 تخفيف بنسبة 1:200 LYVE-1#4 جرذ (ذكر) مُستقبل مانهوليكتيد (MBL) D225-3 تخفيف بنسبة 1:200 Prox-1 أرنب (P) Chemicon AB5475 تخفيف بنسبة 1:1000 Prox-1 ماعز (P) يُعد تحليل الكيمياء النسيجية المناعية للعينة الكاملة (Whole-mount immunohistochemical analysis) لتصوير الأوعية الدموية بأكملها أمراً محورياً لفهم الآليات الخلوية للتخلق التشعبي. لقد طورنا نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة التطور الوعائي، حيث يتم إعادة تنظيم ضفيرة شعيرية بدائية موجودة مسبقاً إلى شبكة وعائية متفرعة هرمياً. ويسمح المجهر البؤري للعينة الكاملة (Whole-mount confocal microscopy) مع الوسم المتعدد بتصوير قوي للأوعية الدموية السليمة ومكوناتها الخلوية، بما في ذلك الخلايا البطانية، والخلايا الحولية، وخلايا العضلات الملساء، باستخدام علامات فلورية محددة. وقد أدت التطورات في نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف، بالتزامن مع الدراسات الجينية، إلى تحسين فهم الآليات الجزيئية للتطور الوعائي وتشكيله. كما استُخدم نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة كيف توفر الأعصاب الطرفية قالباً مكانياً لتمايز الشرايين وتشكيلها. يصف هذا المقال المرئي بروتوكولاً بسيطاً وقوياً لصبغ الأوعية الدموية السليمة باستخدام أجسام مضادة متخصصة بالأوعية وأجسام مضادة ثانوية فلورية، وهو بروتوكول قابل للتطبيق على الأعضاء الجنينية الموعاة حيث يمكننا تتبع عملية التطور الوعائي.&D AF2727 تخفيف بنسبة 1:50 نيوروبيلين 2 أرنب (P) تأشير الخلايا 3366 تخفيف بنسبة 1:100 بودوبلانين هامستر سوري (ذكر) بنك الهجينات (Hybridoma Bank) 8.1.1 تخفيف بنسبة 1:200مؤشر الخلايا العضلية الملساء/الخلايا الحولية
<حدود الجدول="1"> جسم مضاد النوع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل αSMA-Cy3 فأر (M)#5 سيجما c-6198 تخفيف بنسبة 1:500#6 NG2 أرنب (P) Chemicon AB5320 تخفيف بنسبة 1:200 SM22α أرنب (P) Abcam ab14106 تخفيف بنسبة 1:200الأجسام المضادة لـGFP مُبلِّغ
<حدود الجدول="1"> الأجسام المضادة النوع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أرنب (P) Invitrogen A11122 تخفيف بنسبة 1:300 GFP جرذ (ذكر) Nacalai tesque 04404-84 تخفيف بنسبة 1:1000 البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كتكوت (P) Chemicon P42212 تخفيف بنسبة 1:300الأجسام المضادة لـ LacZ مراسل
<حدود الجدول="1"> جسم مضاد الأنواع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل β-gal أرنب (P) MP Biomedical 55976 تخفيف بنسبة 1:5000 βجال- (gal-) ماعز (P) AbD Serotec 4600-1409 تخفيف بنسبة 1:500 β-جال كتكوت (P) Abcam ab9361 تخفيف بنسبة 1:200الأجسام المضادة للمحور العصبي الطرفي
<حدود الجدول="1"> جسم مضاد النوع الشركة رقم الكتالوج # ظروف العمل 2H3 فأر (M)#7 بنك الهجينات (Hybridoma Bank) 2H3 تخفيف بنسبة 1:200 Tuj1 فأر (M)#8 Covance MMS-435P تخفيف بنسبة 1:500 بيريفيرين أرنب (P) Chemicon AB1530 تخفيف بنسبة 1:1000الأجسام المضادة لخلايا شوان المهاجرة
<حدود الجدول="1"> BFABP أرنب (P) توماس إمüيبدو أن النص المصدر غير مكتمل ("ller")؛ يرجى تزويد النص الكامل المراد ترجمته.’مختبر#9 تخفيف بنسبة 1:3000(P): جسم مضاد متعدد النسائل، (M): جسم مضاد أحادي النسيلة
#1: يجب استخدام الجسم المضاد Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (من شركة Jackson ImmunoResearch، رقم 127-165-160) كجسم مضاد ثانوي.
<يعد التحليل الكيميائي النسيجي المناعي للعينة الكاملة (Whole-mount immunohistochemical analysis) لتصوير الشبكة الوعائية بأكملها أمراً محورياً لفهم الآليات الخلوية للتخلق التفرعي. لقد طورنا نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة التطور الوعائي، حيث يتم في هذا النموذج إعادة تنظيم ضفيرة شعيرية بدائية موجودة مسبقاً إلى شبكة وعائية متفرعة هرمياً. ويسمح المجهر البؤري للعينة الكاملة (Whole-mount confocal microscopy) مع التوسيم المتعدد بإجراء تصوير دقيق للأوعية الدموية السليمة وكذلك مكوناتها الخلوية، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا الحولية وخلايا العضلات الملساء، باستخدام واسمات فلورية محددة. وقد أدت التطورات في نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف، بالتزامن مع الدراسات الجينية، إلى تحسين فهم الآليات الجزيئية للتطور الوعائي وتشكيله. كما استُخدم نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة كيف توفر الأعصاب الطرفية قالباً مكانياً لتمايز الشرايين وتشكيلها. يصف هذا المقال المرئي بروتوكولاً بسيطاً ودقيقاً لصبغ الأوعية الدموية السليمة باستخدام أجسام مضادة متخصصة بالأوعية وأجسام مضادة ثانوية فلورية، وهو بروتوكول قابل للتطبيق على الأعضاء الجنينية ذات التروية الدموية حيث يمكننا تتبع عملية التطور الوعائي."يعد التحليل الكيميائي النسيجي المناعي للعينة الكاملة (Whole-mount immunohistochemical analysis) لتصوير الأوعية الدموية بأكملها أمرًا محوريًا لفهم الآليات الخلوية للتخلق التشعبي. لقد قمنا بتطوير نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة التطور الوعائي، حيث يتم إعادة تنظيم ضفيرة شعيرية بدائية موجودة مسبقًا لتتحول إلى شبكة وعائية متفرعة هرميًا. ويسمح المجهر البؤري (confocal microscopy) للعينة الكاملة مع التوسيم المتعدد بتصوير قوي للأوعية الدموية السليمة ومكوناتها الخلوية، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا الحولية وخلايا العضلات الملساء، باستخدام علامات فلورية محددة. وقد أدى التقدم في نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف، بالتزامن مع الدراسات الجينية، إلى تحسين فهم الآليات الجزيئية للتطور الوعائي وتشكيله. كما استُخدم نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة كيفية توفير الأعصاب الطرفية لقالب مكاني لتمايز الشرايين وتشكيلها. يصف هذا المقال المرئي بروتوكولًا بسيطًا وقويًا لصبغ الأوعية الدموية السليمة باستخدام أجسام مضادة متخصصة بالأوعية وأجسام مضادة ثانوية فلورية، وهو بروتوكول قابل للتطبيق على الأعضاء الجنينية ذات التروية الوعائية حيث يمكننا تتبع عملية التطور الوعائي.">#2: يمكن استخدام جسم المضاد للكولاجين IV (Collagen IV antibody) للكشف عن الأوعية الدموية بعد في الموقع التهجين.<يبدو أن النص المصدر غير مكتمل (يتكون فقط من وسم HTML "p class="). يرجى تزويدي بالنص العلمي الكامل المراد ترجمته."يعد التحليل المناعي النسيجي الكيميائي للعينة الكاملة (Whole-mount) لتصوير الشبكة الوعائية بأكملها أمراً محورياً لفهم الآليات الخلوية لتخلق التفرع (branching morphogenesis). لقد قمنا بتطوير نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة التطور الوعائي، حيث يتم إعادة تنظيم ضفيرة شعيرية بدائية موجودة مسبقاً إلى شبكة وعائية متفرعة هرمياً. ويسمح المجهر البؤري (confocal microscopy) للعينة الكاملة مع الوسم المتعدد بتصوير قوي للأوعية الدموية السليمة، بالإضافة إلى مكوناتها الخلوية بما في ذلك الخلايا البطانية، والخلايا الحولية، وخلايا العضلات الملساء، وذلك باستخدام واسمات فلورية محددة. وقد أدت التطورات في نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف مع الدراسات الجينية إلى تحسين فهم الآليات الجزيئية للتطور الوعائي وتشكله. كما استُخدم نموذج الأوعية الدموية لجلد الطرف لدراسة كيفية توفير الأعصاب الطرفية لقالب مكاني لتمايز الشرايين وتشكلها. يصف هذا المقال المرئي بروتوكولاً بسيطاً وقوياً لصبغ الأوعية الدموية السليمة باستخدام أجسام مضادة نوعية للأوعية وأجسام مضادة ثانوية فلورية، وهو بروتوكول قابل للتطبيق على الأعضاء الجنينية الموعاة حيث يمكننا تتبع عملية التطور الوعائي.">#3: يتكرم Alex Kolodkin بتوفير جسم مضاد Neuropilin1’مختبر في جامعة جونز هوبكنز. يتوفر الجسم المضاد لـ Neuropilin1 البشري والمستخلص من الأغنام في R&D (AF3870)، على الرغم من أننا لم نختبره بعد.#4: تكتشف أجسام LYVE-1 المضادة أيضاً مجموعة فرعية من الخلايا البلعمية في الجلد الجنيني.
#5: الجسم المضاد المضاد لـαإن الجسم المضاد لـ SMA هو جسم مضاد أحادي النسيلة من نوع IgG2a الفأري.
#6: المرتبط بـ Cy3 αيتم تحضين جسم المضاد SMA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأجسام المضادة الأولية الأخرى.
#7: الجسم المضاد 2H3 هو جسم مضاد أحادي النسيلة من نوع mouse IgG1 مضاد للـ neurofilament.
#8: الجسم المضاد Tuj1 هو جسم مضاد أحادي النسيلة من النوع mouse IgG2a ضد بيتا-توبولين من الفئة الثالثة الخاص بالعصبونات.
#9: تبرع توماس إم (Thomas M) بلطف بالأجسام المضادة لبروتين ربط الأحماض الدهنية النوعي للدماغ (BFABP).üيبدو أن النص المصدر غير مكتمل ("ller")، يرجى تقديم النص الكامل المراد ترجمته.’مختبر في Max-Delbrüüمركز ck للطب الجزيئي.
المراجع
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
