مقالة منهجية

يرتبط فخ كروموسوم لتحديد الحمض النووي تفاعلات طويلة المدى

15.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/2621

⸱

أبريل 23, 2011

 , 
1Medical Service, VA Palo Alto Health Care System , Stanford University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يُعد مقايسة مصيدة الكروموسومات المرتبطة (ACT) طريقة جديدة غير متحيزة لتحديد تفاعلات DNA طويلة المدى. وسيتيح لنا توصيف تفاعلات DNA طويلة المدى تحديد العلاقة بين البنية النووية والتعبير الجيني في كل من الحالة الفسيولوجية الطبيعية وحالات المرض.

الملخص

تُنظم المعلومات الوراثية المشفرة بواسطة DNA في بنية كروماتين معقدة وعالية التنظيم. ويشغل كل كروموسوم منطقة محددة، قد تتغير وفقاً لمرحلة النمو أو دورة الخلية. ويمكن أن يحدث التعبير الجيني في مصانع نسخ متخصصة حيث قد تبرز قطع من الكروماتين في حلقات من مناطق كروموسومية مختلفة، مما يؤدي إلى التوضع المشترك لقطع DNA التي قد توجد على كروموسومات مختلفة أو تكون متباعدة على الكروموسوم نفسه. يوفر اختبار مصيدة الكروموسومات المرتبطة (ACT) منهجية فعالة لتحديد هذه الارتباطات بعيدة المدى لـ DNA بطريقة غير متحيزة، وذلك من خلال توسيع وتعديل تقنية التقاط التشكيل الكروموسومي. يتيح اختبار ACT إمكانية استقصاء آليات التنظيم النسخي في وضع trans، ويمكن أن يساعد في توضيح العلاقة بين البنية النووية والتعبير الجيني في الحالة الفسيولوجية الطبيعية وأثناء الحالات المرضية.

البروتوكول

1. تثبيت تفاعلات الكروماتين بعيدة المدى باستخدام الفورمالديهايد

  1. يتم استزراع الخط الخلوي البشري HL-60 في وسط RPMI1640 مع 15% FBS و 1 x penicillin/streptomycin حتى تصل نسبة الالتحام إلى 80-90% في حضانة مزودة بـ 5% CO2 عند 37°C.
  2. تُجمع الخلايا في أنبوب Nunc سعة 50-ml، ثم تُطرد مركزياً بسرعة 1,200 rpm لمدة 15 دقيقة، وبعد ذلك يتم إزالة الوسط عن طريق الشفط.
  3. يُضاف 5 ml من وسط الاستزراع لإعادة تعليق كرات الخلايا، وتُعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). تُؤخذ حوالي 1 x 107 خلية في حجم 40 ml من RPMI1640 /10% FBS، ثم يُضاف 1.7 ml من formaldehyde بتركيز 37% لتثبيت الكروماتين المخفف.
  4. تُحضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع الرج الخفيف، ثم يتم إيقاف التفاعل بإضافة 2.4 ml من glycine بتركيز 2M. تُطرد العينة مركزياً لمدة 15 دقيقة بسرعة 1,200 rpm عند 4°C، ويُزال السائل الطافي. تُغسل الكرات مرة واحدة باستخدام 40 ml من PBS بارد جداً، ثم تُطرد الكرات مركزياً ويُزال PBS.

2. تحلل الخلايا لعزل النوى

  1. أعد تعليق الخلايا في 40 ml من محلول التحلل المبرد بالثلج (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0.2% NP-40) مع إضافة مثبطات البروتياز حديثاً (بتخفيف 1:500) و0.1 mM PMSF. قم بالتحضين في غرفة باردة مع التدوير لمدة 90 دقيقة، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي بسرعة 2,500 rpm لمدة 15 دقيقة، وأزل الطافي.

3. الهضم باستخدام إنزيم القطع Bgl II

  1. أعد تعليق النوى في 0.5 مل من 1 x NEB buffer 3، ثم أضف 15 μlof 10% SDS. يتم التحضين عند 37°C لمدة ساعة واحدة مع الرج، ثم يُضاف 45 μl من Triton X-100 بتركيز 20% لعزل SDS. قم بالتحضين عند 37°C لمدة ساعة واحدة مع الرج.
  2. استخدم عينة جزئية بمقدار 1 × 106 نوى (حوالي 15 μg، عُشر الخلايا الأصلية) لهضم إنزيم القطع. اسحب 55 μl من محلول النوى الناتج من الخطوة 3.1 واستكمال الحجم إلى 500 μl مع 433 μl من محلول NEB buffer 3 بتركيز 1x و 12 μl من Bgl II(50 وحدة/ميكرولتر). يتم التحضين عند 37°C طوال الليل.

4. ربط قطع DNA المتفاعلة

  1. قم بإبطال مفعول إنزيم القطع عن طريق إضافة 95 μl من SDS بتركيز 10%، ثم قم بعملية المسخ بالتسخين عند 65 °C لمدة 20 دقيقة في حمام مائي.
  2. أضف 7 ml من منظم الربط (ligation buffer) بتركيز 1 x (30 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) و 360 μl من Triton X-100 بتركيز 20%، ثم حضن المزيج عند 37°C لمدة ساعة واحدة.
  3. اخفض درجة الحرارة إلى 16°C وأضف 50 μl من T4 DNA ligase بتركيز 400 U/μl. حضن العينة عند 16 °C لمدة 4 ساعات، ثم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

5. تنقية الحمض النووي DNA

  1. أضف 300 μg من البروتينيز K، ثم حضّن المزيج عند 65°C طوال الليل.
  2. أضف 5 μg من RNase A وحضّن المزيج عند 37°C لمدة 30 دقيقة.
  3. قم بتنقية DNA عن طريق الاستخلاص بالفينول/الكلوروفورم، ثم رسب DNA في الإيزوبروبانول. أذب DNA في 150 μl من الماء المقطر المعقم.

6. الهضم باستخدام Msp I والربط باستخدام روابط قليلة النوكليوتيد

  1. يُحضن 2μg من الحمض النووي DNA المنقى مع 5 وحدات من إنزيم Msp I عند درجة حرارة 37°C لمدة تتراوح بين 4-6 ساعات. يتم تثبيط نشاط Msp I عند درجة حرارة 65°C لمدة 10 دقائق، ثم يُرسب الـ DNA في الإيثانول مع إضافة 1 μl من الجليكوجين بتركيز 5 mg/ml. تُذاب كتلة الـ DNA في 50 μl من الماء المقطر المعقم.
  2. يُخلط 50 μl من الـ DNA المعالج بإنزيم Msp I مع 2 μl من أوليغونوكليوتيد الرابط L بتركيز 20 μM (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3')، و1 μl من الأوليغونوكليوتيد S بتركيز 20 μM (5'-cggtgaatc-3')، و1 μl من الماء المقطر المعقم، و6 μl من منظم T4 DNA ligase buffer بتركيز 10 x. يُغطى الخليط بالشمع السائل.
  3. تُنزع طبيعة الأوليغونوكليوتيدات عند درجة حرارة 50°C لمدة دقيقة واحدة، ثم تُترك لتبرد تدريجياً حتى تصل إلى 10°C بمعدل تدرج 0.5°C/دقيقة باستخدام جهاز التدوير الحراري (thermal cycler).
  4. يُضاف 1 μl من إنزيم T4 DNA ligase بتركيز 400 U/μl ويُحضن عند درجة حرارة 15°C طوال الليل. يتم تنقية الـ DNA المرتبط بالرابط باستخدام طقم QIAquick PCR Purification، ويُستخلص في 50 μl من الماء المقطر المعقم.

7. تضخيم PCR وتحليل التسلسل

  1. اختر بادئاً للمنطقة المحددة من DNA التي ترغب في فحص التفاعلات طويلة المدى فيها (أي "الطعم"). في هذا المثال، نستخدم ABL-1.
  2. خذ 1 μl من DNA المنقى لإجراء الجولة الأولى من تفاعل PCR باستخدام 1 μl من البادئ النوعي ABL-1 بتركيز 20 μM رقم 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3')، و 1 μl من البادئ النوعي للرابط (linker) بتركيز 20 μM رقم 2963 (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3')، و 3 μl من خليط Klen Taq DNA polymerase I بتركيز 3 x، و 3 μl من الماء المقطر المعقم. يُضاف 2 μl من 32P-dCTP إلى 100 μl من خليط Klen Taq DNA polymerase I بتركيز 3 x قبل تضخيم PCR. تكون الدورة الحرارية لتفاعل hot start PCR كالتالي: 72°C لمدة 2 min، ثم 95°C لمدة 2 min؛ ثم 18 دورة تتكون من 95°C لمدة 20 sec، و 65°C لمدة 40 sec، و 72°C لمدة 1 min؛ وتُجرى مرحلة التمديد النهائية عند 72°C لمدة 5 min.
  3. قم بتنقية نواتج الجولة الأولى من PCR باستخدام مجموعة QIAquick PCR Purification، واستخلص DNA في 30 μl من الماء المقطر المعقم.
  4. خذ 1 μl من ناتج PCR الأول المخفف 100 مرة لإجراء جولة ثانية من PCR باستخدام بادئات متداخلة (nested primers) عن طريق إضافة 1 μl من البادئ النوعي ABL-1 بتركيز 20 μM رقم 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3') (الشكل 1a)، و 1 μl من البادئ النوعي للرابط بتركيز 20 μM رقم 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3')، و 3 μl من خليط Klen Taq DNA polymerase I بتركيز 3 x، و 3 μl من الماء المقطر المعقم. يكون جدول الدورات الحرارية 25 دورة من 95°C لمدة 20 sec، و 67°C لمدة 40 sec، و 72°C لمدة 1 min، يليه تمديد عند 72°C لمدة 5 min.
  5. قم بتصور نواتج PCR عن طريق تشغيل هلام urea-PAGE بتركيز 5% ومسح الشاشة المعرضة في جهاز PhosphoImager (الشكل 1b). يمكن استعادة كل حزمة PCR من الهلام عن طريق إذابة شرائح الهلام في أنبوب Eppendorf يحتوي على 60 μl من الماء المقطر المعقم، والتحضين عند 95°C لمدة 5 min. قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة عند 10,000 rpm لمدة 10 sec لجمع كافة العينات. اسحب 1 μl لاستخدامه كقالب DNA لإجراء PCR باستخدام زوج البادئات 2961/4626 تحت نفس الظروف الموصوفة أعلاه. يمكن إجراء تحليل التسلسل بعد التنقية باستخدام مجموعة QIAquick PCR Purification.
  6. تُحلل تسلسلات DNA باستخدام أداة عبر الإنترنت لتحديد موقعها الكروموسومي على الموقع الإلكتروني: http://genome.ucsc.edu (الشكل 1c). انقر على 'BLAT' للدخول إلى نافذة جديدة تسمح بلصق تسلسل DNA، وتظهر نافذة جديدة بعد النقر على 'submit' تعرض 'BLAT Search Results'. انقر على 'browser' للنتيجة التي تظهر تطابقاً بنسبة 100% للدخول إلى النافذة التالية التي تعرض موقع تسلسل DNA.

8. النتائج التمثيلية

1. مقايسة ACT باستخدام منطقة ABL-1 كطعم لتحديد تفاعلات الحمض النووي طويلة المدى الخاصة بها

كما هو موضح في الشكل 1a، تم اختيار موقعين لإنزيم Bgl II وموقع واحد لإنزيم BamH I لاختبار ACT. وفي الجولة الثانية من تفاعل PCR، استُخدمت مجموعة البادئات 4626/2961 لتضخيم ABL-M1، والمجموعة 4630/2961 لـ ABL-M2، والمجموعة 4636/2961 لـ ABL-M3. ويظهر نمط الهلام النموذجي حزمة واحدة أو عدة حزم (الشكل 1b). تتكون كل قطعة ناتجة عن اختبار ACT من قطعتين مدمجتين من DNA: إحدى القطعتين مشتقة من منطقة DNA الطُعم (bait DNA)، بينما تأتي القطعة الثانية من الشريك المرتبط، والذي تم ربطه بقطعة منطقة الطُعم عن طريق تسلسل التعرف الخاص بإنزيم القطع الأول. أما تسلسل التعرف الخاص بالإنزيم الثاني فيظهر في نهاية تسلسل الشريك المرتبط (الشكل 1c). تحتوي قطعة ABL-M1 المستنسخة على DNA من منطقة ABL1 الواقعة في الكروموسوم 9q32.4 من +133,592,306-133,592,399، ويقع الشريك المرتبط في الكروموسوم 3p13 من +71,869,882-71,870,107. ويتم الكشف عن هويات الشركاء المرتبطين عن طريق تحليل تسلسلاتهم باستخدام BLAST عبر متصفح جينوم UCSC (الإصدار GRCh7/hg19 الصادر في فبراير 2009). وقد تم تحديد PROK2 كشريك مرتبط في الموقع chr3p13.

وبالمثل، تم تحديد موقع الشريك المرتبط بـ ABL-M2 في chr5q21.1، بينما تم تحديد المستنسخ ABL-M3 على أنه ارتباط داخل الكروموسوم بالقرب من موقع ABL-1.

2. تحديد التفاعلات طويلة المدى الأقل شيوعاً باستخدام مقايسة ACT

أبلغت مقاييس أخرى تعتمد على تقنية 3C عن وجود شركاء تفاعل أكثر بكثير مما عرضناه في الشكل 1 وعند موضع Igf2/H1912. ستعمل المنهجية التي حددناها على اختيار التفاعلات بعيدة المدى الأكثر شيوعاً. ومع ذلك، فمن خلال زيادة عدد دورات PCR، يمكن تحديد ارتباطات إضافية أقل تكراراً أيضاً (الشكل 2).

3. الاختلافات في التفاعلات طويلة المدى في الخلايا السرطانية عند مقارنتها بالأنسجة الطبيعية.

يمكن استخدام مقايسة ACT أيضاً لتحديد الاختلافات في البنية النووية والتفاعلات بعيدة المدى بين الخلايا الطبيعية والخلايا السرطانية (الشكل 3). قد تعكس هذه الاختلافات تغيرات في البنية النووية تحدث أثناء التحول الخلوي، وبالتالي قد تكون هذه المقايسة قابلة للتطبيق في أغراض تشخيصية في نهاية المطاف. وقد أشارت أنماط الهلام المتشابهة التي ظهرت في كل من الأنسجة الطبيعية والسرطانية إلى أن مقايسة ACT موثوقة وقابلة للتكرار. وبينما يمكن لمقايسة ACT تحديد شركاء DNA بعيدي المدى، فإن هناك حاجة إلى تحليلات إضافية، مثل مقايسات FISH وChIP، للتحقق من وجود الارتباطات المحددة بين المواقع البعيدة. ويمكن بعد ذلك إجراء دراسات جينية وفسيولوجية وكيميائية حيوية لتوضيح الآثار البيولوجية لارتباطات DNA بعيدة المدى هذه.

مخطط لبنية الجين، ونتيجة الرحلان الكهربائي، وتحليل التسلسل لدراسة جين ABL.
الشكل 1 مقايسة ACT باستخدام منطقة ABL-1 كحمض نووي طعم في خلايا HL-60. أ. بنية الـ DNA في منطقة ABL-1. كان إنزيم القطع الأول المستخدم في مقايسة ACT هو Bgl II. كما تم تحديد بوادئ الجولة الثانية من تفاعل PCR بواسطة أسهم وأرقام البوادئ المقابلة. ب. نمط الهلام لمقايسة ACT في 5% urea-PAGE. استُخدم زوج البوادئ 4626/2961 لتضخيم المستنسخة ABL-M1 في تفاعل PCR المتداخل، واستُخدم الزوج 4630/2961 للمستنسخة ABL-M2، والزوج 4636/2961 للمستنسخة ABL-M3. ج. تسلسل الـ DNA للمستنسخة ABL-M1. تم تحديد قطعة الـ DNA من حمض ABL-1 النووي الطعم باللون الأحمر، وتم تحديد شريك الـ DNA المرتبط بها باللون السماوي. كما تم تحديد موقع Bgl II (AGACTC) باللون الأخضر، وموقع Msp I (CCGG) باللون الأرجواني.

تحليل دورات PCR؛ نتائج الرحلان الكهربائي؛ مقارنة تضخيم DNA؛ علامة حزم الهلام.
الشكل 2 تؤثر دورات PCR على نتائج مقايسة ACT. باستخدام منطقة التحكم في البصمة الجينية (ICR) في موضع Igf2/H19 كـ DNA طعم في خلايا أرومة ليفية للفأر، تم تطبيق برامج دورات مختلفة في الجولتين الأولى والثانية من PCR في مقايسة ACT. لم تؤدِّ 18-20 دورة في الجولة الأولى من PCR إلى تضخيم إشارة كافية ليتم تصورها. أسفرت خمس وعشرون دورة في الـ PCR الثانية عن ظهور حزم واضحة، بينما أدى زيادة عدد الدورات في الجولة الثانية من PCR إلى ظهور نمط تلطيخ بالإضافة إلى المزيد من الحزم.

تحديد مواقع ارتباط CTCF باستخدام هضم DpnII؛ الرحلان الكهربائي للحمض النووي DNA في الأنسجة الطبيعية مقابل الأنسجة السرطانية.
الشكل 3 الكشف عن الاختلافات في البنية النووية بين أنسجة القولون الطبيعية وأنسجة سرطان القولون في مقايسة ACT. أ. بنية DNA لمنطقة ICR في موقع IGF2/H19 وجين IGF2. تم تحديد مواقع Dpn II الخاصة بمقايسة ACT. تم تحديد البادئات المستخدمة في الجولة الثانية من PCR بواسطة أسهم وأرقام بألوان مختلفة تتوافق مع كل ممر في اللوحة ب من الشكل. ب. نمط الجل لمقايسة ACT في 5% urea-PAGE. تم الحصول على أنسجة القولون الطبيعية MAD03-1423 وأنسجة سرطان القولون MAD04-149 من الشبكة التعاونية للأنسجة البشرية (CHTN) القسم الغربي. بعد تجنيس كل نسيج قولون، تم إجراء مقايسة ACT وفقاً للإجراءات الموضحة هنا. يمثل الممر 1 نتائج PCR باستخدام زوج البادئات #2961 و #4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3') المحددة باللون الوردي في اللوحة أ؛ ويمثل الممر 2 نتائج PCR باستخدام زوج البادئات #2961 و #4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3') المحددة باللون البرتقالي في اللوحة أ؛ ويمثل الممر 3 نتائج PCR باستخدام زوج البادئات #2961 و #5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') المحددة باللون الأزرق في اللوحة أ؛ ويمثل الممر 4 نتائج PCR باستخدام زوج البادئات #2961 و #5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3') المحددة باللون الأخضر في اللوحة أ. تم تحديد النطاقات الفريدة التي تظهر فقط في أنسجة القولون الطبيعية بأسهم صفراء، والنطاقات التي ظهرت فقط في أنسجة سرطان القولون بأسهم حمراء. ICR، منطقة التحكم في البصم الجيني؛ DMR، المنطقة متباينة الميثيلة.

المناقشة

طوّر Dekker et al. نهج التقاط تشكيل الكروموسوم (3C) للكشف عن تكرار التفاعل بين موقعين جينوميين1، وقد استُخدم 3C على نطاق واسع لاستقصاء الارتباطات داخل الكروموسوم وبين الكروموسومات بين منطقتين معلومتين من DNA في الخلايا الثديية2-9. وعلى الرغم من إمكانية تطبيق منهجية Hi-C المطورة حديثًا لدراسة ارتباط DNA على نطاق الجينوم بأكمله، إلا أن مقايسة ACT لا تزال تقنية فعالة لدراسة تفاعل DNA الخاص بموقع معين10-11. لقد قمنا بتعديل هذا النهج لتحديد مناطق DNA غير المعروفة المرتبطة بمنطقة DNA معلومة في خلايا الفئران والبشر المستزرعة (الشكل 1). وأطلقنا على هذه الطريقة اسم مقايسة فخ الكروموسوم المرتبط (ACT)، لأنها وفرت لنا طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لتحديد شركاء DNA جدد غير معروفين يرتبطون بمنطقة DNA مستهدفة معلومة12. يتم إجراء مقايسة 3C ناجحة مع ضوابط مناسبة قبل تنفيذ الجوانب الجديدة من مقايسة ACT13. ومن أجل العثور على أكبر عدد ممكن من مناطق DNA المرتبطة، من الضروري استخدام تركيبات مختلفة من إنزيمات القطع الأولى والثانية. ومن المهم بشكل خاص استخدام إنزيمات قطع غير حساسة لمثيلة CpG لإجراء خطوة ربط 3C الأولى. كما يمكن أن يؤثر ارتباط البروتين ومثيلة DNA على كفاءة هضم إنزيم القطع، وقد يؤدي ذلك إلى فشل ربط مناطق DNA المرتبطة في بعض عمليات هضم إنزيمات القطع. يعتمد حدوث الربط داخل الكروموسوم أو بين الكروموسومات على الربط التشابكي بين البروتين وDNA والخرائط الفيزيائية المناسبة لكلتا منطقتي DNA المرتبطتين. وبالتالي، فإن بعض التجارب الأولية ضرورية لتحديد تركيز فورمالدهيد ووقت معالجة فعالين وعمليين في مقايسة ACT. وقد استُخدمت مجموعة من التركيزات النهائية للفورمالدهيد (من 1.5% إلى 2%) في عدة مختبرات خلال جزء 3C من المقايسة7,9. وبدلاً من ذلك، يمكن تصميم قليلات النوكليوتيد المستخدمة كروابط لتتطابق مع النهاية المتماسكة التي يقطعها إنزيم القطع الثاني. ورغم أننا وجدنا أن 18-20 دورة في الجولة الأولى من PCR و20-25 دورة في الجولة الثانية من PCR يمكن أن توفر حزمًا واضحة، إلا أنه من الضروري تحديد أفضل ظروف PCR لكل تجربة (الشكل 2). قد يحدث تلدين داخل الجزيء بين تسلسل المهايئ المكمل للنهاية '5 والنهاية '3 لشريط DNA أثناء PCR، مما يثبط تلدين البادئ الخاص بالمهايئ مع جزيء DNA، ويؤدي إلى كفاءة تضخيم أقل بكثير في الدورات القليلة الأولى. بعد تضخيم DNA المستهدف لعدة دورات، قد تصبح كميته أكبر بكثير من هذه التفاعلات غير النوعية، مما قد يسهل تنافس تلدين البادئ مع جزيئات DNA المستهدفة. وهذا هو السبب أيضًا في أننا قد نرى تضخيمًا خلفيًا، وسبب وجوب تخفيف ناتج الجولة الأولى من PCR لتقليل التضخيم الخلفي. من المهم إزالة البادئات الزائدة من تفاعل PCR من أجل تقليل الخلفية في الجولة الثانية من PCR. وكما هو الحال في جميع التجارب القائمة على PCR، من الضروري تصميم بادئات لا تقع في مناطق التسلسل المتكرر، والتي تشكل غالبية DNA البشري والفأري. وعلى الرغم من إمكانية تطبيق منهجية Hi-C المطورة حديثًا لدراسة ارتباط DNA على نطاق الجينوم بأكمله، إلا أن مقايسة ACT لا تزال تقنية فعالة لدراسة تفاعل DNA الخاص بموقع معين.

الإفصاحات

لم يتم الإبلاغ عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نتقدم بجزيل الشكر إلى Adelle Murell وWolf Reik لمشاركتنا بروتوكول 3C الخاص بهما. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع ومصلحة الأبحاث التابعة لوزارة شؤون المحاربين القدامى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسط RPMI1640Invitrogen22400-105
أكريلاميدInvitrogen15512-023
محلول ATP، بتركيز 10 ملي مولارInvitrogenAM8110G
مصل جنين البقرInvitrogen16000-044
بنسلين-ستربتوميسينInvitrogen15140-122
1 مولار تريس (Tris) برقم هيدروجيني 8.0InvitrogenAM9856
الرناز أ (RNase A)Invitrogen12091-039
SDS (دوديسيل كبريتات الصوديوم)Invitrogen15525-017
اليورياInvitrogen15505-035
<مجهر إلكتروني>BamHI أناNew England BiolabsR0136T
<مجهر إلكتروني>Bgl ٢New England BiolabsR0144M
<إلكترون مجهري>إنزيم DpnI ٢New England BiolabsR0543T
<مجهر إلكتروني (EM)>Msp أناNew England BiolabsR0106S
ديوكسي ريبونوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)New England BiolabsN0447L
بروتيناز KNew England BiolabsP8102S
إنزيم تي 4 دي إن إيه ليجيز (T4 DNA ligase)New England BiolabsM0202T
فورمالديهايد بتركيز 37%Sigma-AldrichF8775
بيس-أكريلاميدSigma-Aldrich146072
ديثيوثريتولSigma-Aldrich43815
جلايسينSigma-Aldrich50046
فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF)Sigma-Aldrich93482
مثبط البروتينازSigma-AldrichS8830
Nonidet P-40مجموعة روش (Roche Group)11754599001
KlenTaq1ببتيدات الأجسام المضادة1001
dCTP alpha P32PerkinElmer, Inc.BLU513H250UC
جهاز التدوير الحراري PTC-100إم جيه ريسيرش (MJ Research)مجPtC100
مزود الطاقةBio-Rad164-5056
OmniPAGE Maxiأوروجين لعلوم الحياة (Aurogene Life Science)VS20D
Typhoon 9400GE Healthcare63-0055-78

المراجع

  1. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295, 1306-1311 (2002).
  2. Apostolou, E., Thanos, D. Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression. Cell. 134, 85-96 (2008).
  3. Duan, Z. A three-dimensional model of the yeast genome. Nature. 465, 363-367 (2010).
  4. Lomvardas, S. Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice. Cell. 126, 403-413 (2006).
  5. Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops. Nat Genet. 36, 889-893 (2004).
  6. Schoenfelder, S. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat Genet. 42, 53-61 (2010).
  7. Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. Interchromosomal associations between alternatively expressed loci. Nature. 435, 637-645 (2005).
  8. Vakoc, C. R. Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1. Mol Cell. 17, 453-462 (2005).
  9. Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation. Science. 311, 1149-1152 (2006).
  10. Lieberman-Aiden, E. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  11. Berkum, N. L. van Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes. J Vis Exp. , (2010).
  12. Ling, J. Q. CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1. Science. 312, 269-272 (2006).
  13. Dekker, J. The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nat Methods. 3, 17-21 (2006).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التقاط تشكل الكروموسوماتالهضم بإنزيم القطعربط الحمض النوويتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسلعزل النوىالرحلان الكهربائي للهلامتحليل التسلسلالبنية النووية
يرتبط فخ كروموسوم لتحديد الحمض النووي تفاعلات طويلة المدى
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.