مقالة منهجية

يرتبط فخ كروموسوم لتحديد الحمض النووي تفاعلات طويلة المدى

DOI:

10.3791/2621

⸱

أبريل 23, 2011

 , 
1Medical Service, VA Palo Alto Health Care System , Stanford University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقايسة مصيدة الكروموسوم المرتبطة (ACT) هي طريقة جديدة غير متحيزة لتحديد تفاعلات الحمض النووي بعيدة المدى. سيسمح لنا توصيف تفاعلات الحمض النووي بعيدة المدى بتحديد علاقة الهندسة النووية بالتعبير الجيني في كل من علم وظائف الأعضاء الطبيعي وفي الحالات المريضة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنظيم المعلومات الجينية المشفرة بواسطة الحمض النووي في بنية كروماتين معقدة ومنظمة للغاية. يحتل كل كروموسوم منطقة معينة ، والتي قد تتغير وفقا لمرحلة التطور أو دورة الخلية. يمكن أن يحدث التعبير الجيني في مصانع النسخ المتخصصة حيث قد تخرج أجزاء الكروماتين من مناطق كروموسومات مختلفة ، مما يؤدي إلى التوطين المشترك لأجزاء الحمض النووي التي قد توجد على كروموسومات مختلفة أو متباعدة على نفس الكروموسوم. يوفر اختبار مصيدة الكروموسوم المرتبطة (ACT) منهجية فعالة لتحديد ارتباطات الحمض النووي بعيدة المدى بطريقة غير متحيزة من خلال توسيع وتعديل تقنية التقاط تشكل الكروموسوم. يتيح لنا اختبار ACT التحقيق في آليات تنظيم النسخ في العابرة ، ويمكن أن يساعد في تفسير علاقة الهندسة النووية بالتعبير الجيني في علم وظائف الأعضاء الطبيعي وأثناء حالات المرض.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فئة

1. تثبيت الفورمالديهايد لتفاعلات الكروماتين بعيدة المدى

  1. استزراع خط الخلية البشرية HL-60 في وسط RPMI1640 مع 15٪ FBS و 1 × بنسلين / ستربتومايسين إلى 80-90٪ التقاء في حاضنة مزودة ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية.
  2. اجمع الخلايا في أنبوب Nunc سعة 50 مل ، وجهاز طرد مركزي بسرعة 1,200 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة ، ثم قم بإزالة الوسط عن طريق الشفط
  3. أضف 5 مل من وسط الثقافة لإعادة تعليق كريات الخلية ، وعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. خذ ما يقرب من 1 × 107 خلايا إلى حجم 40 مل مع RPMI1640 /10٪ FBS ، ثم أضف 1.7 مل من 37٪ فورمالديهايد لإصلاح الكروماتين المخفف.
  4. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع رج لطيف ، ثم ارويها ب 2.4 مل من 2M glycine. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 1,200 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية. اغسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام 40 مل من PBS المثلج ، ثم قم بتدوير الحبيبات وإزالة PBS.
< p class = "jove_title" >2. تحلل الخلية لعزل النوى
  1. أعد تعليق الخلايا في 40 مل من محلول التحلل المثلج (10 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 10 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.2٪ NP-40) مع مثبطات البروتياز المضافة حديثا (1: 500 مخفف) و 0.1 ملي PMSF. احتضن في غرفة باردة مع دوران لمدة 90 دقيقة ، وجهاز الطرد المركزي عند 2,500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة ، وقم بإزالة المادة الطافية.
< p class = "jove_title" >3. تقييد إنزيم الهضم مع Bgl II
  1. أعد تعليق النوى في 0.5 مل من 1 × NEB buffer 3 ، وأضف 15 ميكرولتر من 10٪ SDS. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع الرج ، ثم أضف 45 ميكرولتر من 20٪ Triton X-100 لعزل SDS. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الرج.
  2. استخدم حصة من 1 × 106 نوى (حوالي 15 ميكروغرام ، عشر الخلايا الأصلية) لهضم إنزيم التقييد. أخرج 55 ميكرولتر من محلول النوى من الخطوة 3.1 واصنع ما يصل إلى 500 ميكرولتر مع 433 ميكرولتر من 1 × NEB buffer 3 و 12 ميكرولتر من Bgl II (50U / ul). احتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
فئة

4. ربط مقاطع الحمض النووي المتفاعلة

  1. قم بتعطيل إنزيم التقييد عن طريق إضافة 95 ميكرولتر من 10٪ SDS ، وتغيير الطبيعة عن طريق التسخين عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في حمام مائي.
  2. أضف 7 مل من 1 × مخزن مؤقت للربط (30 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 10 ملي ملي MgCl2 ، 10 ملي DTT ، 1 ملي ATP) و 360 ميكرولتر من 20٪ Triton X-100 واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  3. اخفض درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية وأضف 50 ميكرولتر من 400 وحدة / ميكرولتر T4 DNA ligase. احتضان العينة عند 16 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ثم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
فئة

5. تنقية الحمض

النووي
  1. أضف 300 ميكروغرام من البروتيناز K ، واحتضنه عند 65 درجة مئوية طوال الليل.
  2. أضف 5 ميكروغرام من RNase A واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة
  3. تنقية الحمض النووي عن طريق استخراج الفينول / الكلوروفورم ، وترسيب الحمض النووي في الأيزوبروبانول. قم بإذابة الحمض النووي في 150 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم.
< p class = "jove_title" >6. الهضم باستخدام MSP I والربط باستخدام روابط قليل النوكليوتيدات
  1. احتضان 2 ميكروغرام من الحمض النووي المنقى مع 5 وحدات من MSP I عند 37 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعات. قم بتعطيل MSP I عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم قم بترسيب الحمض النووي في الإيثانول ب 1 ميكرولتر من 5 مجم / مل جليكوجين. قم بإذابة حبيبات الحمض النووي في 50 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم.
  2. امزج 50 ميكرولتر من الحمض النووي المعالج ب MSP I مع 2 ميكرولتر من قليل النوكليوتيدات الرابط 20 ميكرومتر L (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 ') ، 1 ميكرولتر من 20 ميكرومتر قليل النوكليوتيدات S (5'-cggtgaatc-3 ') ، 1 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم و 6 ميكرولتر من 10 × T4 DNA ligase buffer. غطي الخليط بالشمع السائل.
  3. تبديل طبيعة قليل النوكليوتيدات عند 50 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة وتترك لتبرد تدريجيا إلى 10 درجات مئوية في تدرج 0.5 درجة مئوية / دقيقة في دورة حرارية.
  4. أضف 1 ميكرولتر من 400 وحدة / ميكرولتر T4 DNA ligase واحتضن عند 15 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قم بتنقية الحمض النووي المرتبط بالوصلة باستخدام مجموعة تنقية QIAquick PCR ، وقم بإزالته في 50 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم.
< p class = "jove_title" >7. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتحليل التسلسل
  1. اختر برايمر لمنطقة معينة من الحمض النووي التي ترغب في فحصها بحثا عن تفاعلات بعيدة المدى (أي "الطعم"). في هذا المثال، نستخدم ABL-1.
  2. خذ 1 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى لإجراء الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام 1 ميكرولتر من 20 ميكرومتر ABL-1 التمهيدي المحدد # 4656 (5'-gttcaagcgattcctgcctcga-3 ') ، 1 ميكرولتر من 20 ميكرومتر برايمر خاص بالرابط # 2963 (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 ') ، 3 ميكرولتر من 3 × كوكتيل Klen Taq DNA polymerase I و 3 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. يضاف ميكرولتر من 32P-dCTP إلى 100 ميكرولتر من 3 × كوكتيل Klen Taq DNA polymerase I قبل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الدورة الحرارية لبدء تفاعل البوليميراز المتسلسل الساخن هي 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ؛ 18 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 65 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ؛ يتم إجراء التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. قم بتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من الجولة الأولى باستخدام مجموعة تنقية QIAquick PCR ، وقم بمسح الحمض النووي في 30 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم.
  4. خذ 1 ميكرولتر من 100 × أول منتج PCR مخفف لإجراء جولة ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات متداخلة عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من 20 ميكرومتر ABL-1 التمهيدي المحدد # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3') (الشكل 1 أ) ، 1 ميكرولتر من 20 ميكرومتر من التمهيدي الخاص بالرابط # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 ') ، 3 ميكرولتر من 3 × كوكتيل Klen Taq DNA polymerase I و 3 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. جدول الدورات الحرارية هو 25 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 67 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، تليها التمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. تصور منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق تشغيل جل اليوريا PAGE بنسبة 5٪ ومسح الشاشة المكشوفة في PhosphoImager (الشكل 1 ب). يمكن إعادة تدوير كل شريط PCR من الجل عن طريق إذابة شرائح الجل في أنبوب Eppendorf يحتوي على 60 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم ، واحتضانه عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة عند 10,000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان لجمع جميع العينات. قم بإزالة 1 ميكرولتر لاستخدامه كقالب DNA لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام زوج التمهيدي 2961/4626 باستخدام نفس الشروط كما هو موضح أعلاه. يمكن إجراء تحليل التسلسل بعد التنقية باستخدام مجموعة تنقية QIAquick PCR.
  6. يتم تحليل تسلسل الحمض النووي باستخدام أداة عبر الإنترنت لتحديد موقع الكروموسومات على موقع الويب: http://genome.ucsc.edu (الشكل 1 ج). انقر فوق "BLAT" للدخول إلى نافذة جديدة تسمح بلصق تسلسل الحمض النووي ، وتظهر نافذة جديدة بعد النقر فوق "إرسال" ، وتظهر "نتائج بحث BLAT". انقر فوق "متصفح" النتيجة بهوية 100٪ للدخول إلى النافذة التالية لإظهار موقع تسلسل الحمض النووي.

8. النتائج التمثيلية

< p class = "jove_step" >1. اختبار ACT باستخدام منطقة ABL-1 كطعم لتحديد تفاعلات الحمض النووي بعيدة المدى < p class = "jove_content" >كما هو موضح في الشكل 1 أ ، تم اختيار موقعين Bgl II وموقع BamH I لمقايسة ACT. في الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تم استخدام مجموعة التمهيدي 4626/2961 لتضخيم ABL-M1 ، وتم استخدام 4630/2961 ل ABL-M2 ، وتم استخدام 4636/2961 ل ABL-M3. يظهر نمط الهلام النموذجي نطاقا واحدا إلى عدة نطاقات (الشكل 1 ب). يتكون كل جزء من اختبار ACT من جزأين مدمجين من الحمض النووي: جزء واحد مشتق من منطقة الحمض النووي للطعم ، بينما يأتي الجزء الثاني من الشريك المرتبط ، والذي تم ربطه بجزء منطقة الطعم بواسطة تسلسل التعرف على إنزيم التقييد الأول. سيظهر تسلسل التعرف على الإنزيم الثاني في نهاية تسلسل الشريك المرتبط (الشكل 1 ج). يحتوي جزء ABL-M1 المستنسخ على الحمض النووي من منطقة ABL1 الموجودة في الكروموسوم 9q32.4 من +133،592،306-133،592،399 ، ويقع الشريك المرتبط في الكروموسوم 3p13 من +71،869،882-71،870،107. يتم اكتشاف هويات الشركاء المرتبطين عن طريق تفجير تسلسلاتهم باستخدام متصفح الجينوم UCSC (GRCh7 / hg19 الذي تم إصداره في فبراير 2009). تم تحديد PROK2 كشريك مرتبط في موضع chr3p13.

وبالمثل ، تم توطين الشريك المرتبط ب ABL-M2 إلى chr5q21.1 ، بينما تم تحديد استنساخ ABL-M3 على أنه ارتباط داخل الكروموسومات بالقرب من موضع ABL-1.

2. تحديد التفاعلات بعيدة المدى الأقل انتشارا باستخدام مقايسة ACT

أبلغت المقايسات الأخرى القائمة على 3C عن العديد من الشركاء المتفاعلين أكثر مما أظهرناه في الشكل 1 وفي Igf2 / H19 الموضع12. ستختار المنهجية التي حددناها التفاعلات طويلة المدى الأكثر انتشارا. ومع ذلك ، من خلال زيادة عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من الممكن تحديد ارتباطات إضافية أقل تواترا أيضا (الشكل 2).

< ص الفئة = "jove_step" >3. الاختلافات في التفاعلات بعيدة المدى في الخلايا السرطانية عند مقارنتها بالأنسجة الطبيعية. < p class = "jove_content" > يمكن أيضا استخدام اختبار ACT لتحديد الاختلافات في الهندسة النووية والتفاعلات بعيدة المدى بين الخلايا الطبيعية والخلايا السرطانية (الشكل 3). قد تعكس هذه الاختلافات تغييرات الهندسة النووية التي تحدث أثناء تحويل الخلية ، وبالتالي قد يكون هذا الاختبار قابلا للتطبيق في النهاية لأغراض التشخيص. أشارت أنماط الهلام المتشابهة التي تحدث في كل من الأنسجة الطبيعية والسرطانية إلى أن اختبار ACT موثوق به وقابل للتكرار. في حين أن مقايسة ACT يمكن أن تحدد شركاء الحمض النووي بعيدي المدى ، فإن هناك حاجة إلى مزيد من التحليلات ، مثل فحوصات FISH و ChIP ، للتحقق من وجود الارتباطات المحددة بين المواقع البعيدة. يمكن بعد ذلك إجراء دراسات وراثية وفسيولوجية وكيميائية حيوية لتوضيح الآثار البيولوجية لارتباطات الحمض النووي طويلة المدى هذه. < p class = "jove_content" >figure-protocol-1
الشكل 1 اختبار ACT باستخدام منطقة ABL-1 كطعم للحمض النووي في خلايا HL-60. أ. بنية الحمض النووي في منطقة ABL-1. كان أول إنزيم تقييد يستخدم في اختبار ACT هو Bgl II. يتم أيضا تصنيف البادئات للجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة الأسهم والأرقام التمهيدية المقابلة. b. نمط هلام لاختبار ACT في 5٪ اليوريا PAGE. تم استخدام زوج التمهيدي 4626/2961 لتضخيم استنساخ ABL-M1 في تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل ، وتم استخدام 4630/2961 لاستنساخ ABL-M2 ، وتم استخدام 4636/2961 لاستنساخ ABL-M3. ج. تسلسل الحمض النووي لاستنساخ ABL-M1. تم تصنيف جزء الحمض النووي من الحمض النووي لطعم ABL-1 باللون الأحمر ، ويتم تصنيف شريك الحمض النووي المرتبط به باللون السماوي. بغل تم تصنيف الموقع الثاني (AGACTC) باللون الأخضر ، وتم تصنيف موقع MSP I (CCGG) باللون الأرجواني.

figure-protocol-2
الشكل 2 تؤثر دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل على نتائج فحص ACT. باستخدام منطقة التحكم في البصمة (ICR) في موضع Igf2 / H19 كطعم للحمض النووي في خلايا الخلايا الليفية للفأر ، تم تطبيق برامج مختلفة للتدوير في الجولتين الأولى والثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل في اختبار ACT. لم تضخم 18-20 دورة في الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل إشارة كافية لتصورها. خمس وعشرون دورة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني ينتج عنه نطاقات واضحة ، بينما تؤدي زيادة عدد الدورات للجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى نمط مسحة بالإضافة إلى المزيد من النطاقات.

figure-protocol-3
الشكل 3 الكشف عن الاختلافات في الهندسة النووية بين أنسجة القولون الطبيعية وأنسجة سرطان القولون في اختبار ACT. أ. هيكل الحمض النووي لمنطقة ICR في موضع IGF2 / H19 وجين IGF2. Dpn يتم تسمية المواقع II لمقايسة ACT. يتم تمييز البادئات المستخدمة في الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل بأسهم وأرقام بألوان مختلفة تتوافق مع كل حارة في اللوحة ب من الشكل. b. نمط هلام لاختبار ACT في 5٪ اليوريا PAGE. تم الحصول على أنسجة القولون الطبيعية MAD03-1423 وأنسجة سرطان القولون MAD04-149 من القسم الغربي لشبكة الأنسجة البشرية التعاونية (CHTN). بعد تجانس كل نسيج من أنسجة القولون ، تم إجراء اختبار ACT باتباع الإجراءات الموضحة هنا. يمثل المسار 1 نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام زوج التمهيدي #2961and # 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ') المسمى باللون الوردي في اللوحة أ ؛ يمثل الممر 2 نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام زوج التمهيدي # 2961 و # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 ') المسمى باللون البرتقالي في اللوحة A ؛ يمثل الممر 3 نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام زوج التمهيدي # 2961 و # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3 ') المسمى باللون الأزرق في اللوحة A ؛ يمثل المسار 4 نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام زوج التمهيدي # 2961 و # 5151 (5'-gtctcaaataggggcagctagcttgg-3 ') المسمى باللون الأخضر في اللوحة A. يتم تمييز العصابات الفريدة التي تظهر فقط في أنسجة القولون الطبيعية بأسهم صفراء ، وتلك العصابات التي ظهرت فقط في أنسجة سرطان القولون يتم تمييزها بأسهم حمراء. ICR ، منطقة التحكم في البصمة ؛ DMR ، منطقة ميثيلية مختلفة.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ديكر وآخرون. طور نهج التقاط تشكل الكروموسوم (3C) للكشف عن تكرار التفاعل بين موقعين جينوميين1 ، و 3C تم استخدامه على نطاق واسع للتحقيق في الارتباطات داخل الكروموسومات وبين الكروموسومات بين منطقتين معروفتين من الحمض النووي في خلايا الثدييات2-9. على الرغم من أنه يمكن تطبيق منهجية Hi-C المطورة حديثا لدراسة ارتباط الحمض النووي على مستوى الجينوم ، إلا أن اختبار ACT لا يزال تقنية فعالة لدراسة تفاعل الحمض النووي الخاص بالموضع10-11. لقد قمنا بتعديل هذا النهج لتحديد مناطق الحمض النووي غير المعروفة المرتبطة بمنطقة DNA معروفة في خلايا الفئران والخلايا البشرية المستزرعة (الشكل 1). أطلقنا على هذه الطريقة مقايسة مصيدة الكروموسوم المرتبطة (ACT) ، لأنها وفرت لنا طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لتحديد شركاء الحمض النووي غير المعروفين الجدد الذين يرتبطون بمنطقة الحمض النووي المستهدفةالمعروفة 12. يتم إجراء اختبار 3C ناجح مع الضوابط المناسبة قبل تنفيذ الجوانب الجديدة لمقايسة ACT13. من أجل العثور على أكبر عدد ممكن من مناطق الحمض النووي المرتبطة ، من الضروري استخدام مجموعات مختلفة من إنزيمات التقييد الأولى والثانية. من المهم بشكل خاص استخدام إنزيمات التقييد غير الحساسة لمثيلة CpG لأداء خطوة الربط 3C الأولى. يمكن أن يؤثر ارتباط البروتين ومثيلة الحمض النووي أيضا على كفاءة هضم إنزيم التقييد ويمكن أن يؤدي إلى فشل ربط مناطق الحمض النووي المرتبطة بهضم إنزيم تقييد معين. يعتمد حدوث الربط داخل الكروموسومات أو بين الكروموسومات على الربط المتقاطع بين البروتين والحمض النووي والخرائط الفيزيائية المناسبة لكل من مناطق الحمض النووي المرتبطة. وبالتالي ، فإن بعض التجارب الأولية ضرورية لتحديد تركيز فورمالديهايد فعال عملي ووقت العلاج في مقايسة ACT. تم استخدام مجموعة من التركيزات النهائية للفورمالديهايد (من 1.5٪ إلى 2٪) في العديد من المختبرات خلال الجزء 3C من الفحص7،9. بدلا من ذلك ، يمكن تصميم قليل النوكليوتيدات المستخدمة كروابط لتتناسب مع النهاية المتماسكة المقطوعة بواسطة إنزيم التقييد الثاني. على الرغم من أننا وجدنا أن 18-20 دورة في الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل و 20-25 دورة في الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل يمكن أن توفر نطاقات واضحة ، فمن الضروري إنشاء أفضل ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل تجربة (الشكل 2). قد يحدث التلدين داخل الجزيء بين تسلسل المحول التكميلي ذو 5 بوصات و 3 نهايات لخيط الحمض النووي في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فهو يثبط التلدين التمهيدي الخاص بالمحول مع جزيء الحمض النووي ، وأدى إلى كفاءة تضخيم أقل بكثير في الدورات العديدة الأولى. بعد تضخيم الحمض النووي المستهدف للدورات ، قد تكون مقدارها أكبر بكثير من هذه التفاعلات غير المحددة ، وقد تسهل منافسة التلدين التمهيدي لجزيئات الحمض النووي المستهدفة. هذا هو السبب أيضا في أننا قد نرى تضخيما في الخلفية ، ولماذا يجب تخفيف منتج PCR للجولة الأولى لتقليل تضخيم الخلفية. من المهم إزالة البادئات الزائدة من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل من أجل تقليل الخلفية في الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). كما هو الحال في جميع التجارب القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من الضروري تصميم بادئات غير موجودة في مناطق تسلسل التكرار ، والتي تشكل غالبية الحمض النووي للإنسان والفأر. على الرغم من أنه يمكن تطبيق منهجية Hi-C المطورة حديثا لدراسة ارتباط الحمض النووي على مستوى الجينوم ، إلا أن اختبار ACT لا يزال تقنية فعالة لدراسة تفاعل الحمض النووي الخاص بالمكان.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر Adelle Murell و Wolf Reik جزيل الشكر لمشاركة بروتوكول 3C الخاص بهم. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع وخدمة الأبحاث التابعة لإدارة شؤون المحاربين القدامى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RPMI1640 متوسطInvitrogen22400-105
أكريلاميدInvitrogen15512-023
محلول ATP ، 10 ملي مولارInvitrogenAM8110G
مصل الأبقار الجنينيInvitrogen16000-044
البنسلين الستربتومايسينInvitrogen15140-122
1M Tris pH8.0InvitrogenAM9856
RNase AInvitrogen12091-039
SDSInvitrogen15525-017
اليورياInvitrogen15505-035
BamH< em> INew England BiolabsR0136T
Bgl< em> IINew England BiolabsR0144M
Dpn< / م > الثانينيو إنجلاند بيولابيسR0543T
< > Msp < / em > INew England BiolabsR0106S
dNTPsNew England BiolabsN0447L
proteinase KNew England BiolabsP8102S
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202T
37٪ فورمالديهايدسيجما ألدريتشF8775
Bis-acrylamideSigma-Aldrich146072
dithiothreitolSigma-Aldrich43815
glycineSigma-Aldrich50046
PMSFSigma-Aldrich93482
مثبط البروتينازSigma-AldrichS8830
Nonidet P-40Roche Group11754599001
KlenTaq1Ab الببتيدات1001
dCTP alpha P32PerkinElmer، Inc.BLU513H250UC
PTC-100 Thermal CyclerMJ Researchmjptc100
مزود الطاقةBio-Rad164-5056
OmniPAGE MaxiAurogene Life ScienceVS20D
Typhoon 9400GE Healthcare63-0055-78

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295, 1306-1311 (2002).
  2. Apostolou, E., Thanos, D. Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression. Cell. 134, 85-96 (2008).
  3. Duan, Z. A three-dimensional model of the yeast genome. Nature. 465, 363-367 (2010).
  4. Lomvardas, S. Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice. Cell. 126, 403-413 (2006).
  5. Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops. Nat Genet. 36, 889-893 (2004).
  6. Schoenfelder, S. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat Genet. 42, 53-61 (2010).
  7. Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. Interchromosomal associations between alternatively expressed loci. Nature. 435, 637-645 (2005).
  8. Vakoc, C. R. Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1. Mol Cell. 17, 453-462 (2005).
  9. Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation. Science. 311, 1149-1152 (2006).
  10. Lieberman-Aiden, E. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  11. Berkum, N. L. van Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes. J Vis Exp. , (2010).
  12. Ling, J. Q. CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1. Science. 312, 269-272 (2006).
  13. Dekker, J. The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nat Methods. 3, 17-21 (2006).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Associated Chromosome TrapLong range DNA InteractionsChromosome Conformation CaptureRestriction Enzyme DigestionDNA LigationPCR AmplificationNuclei IsolationGel ElectrophoresisSequence AnalysisNuclear Architecture

مقالات ذات صلة