مقالة منهجية

A β غلوكورونيداز (GUS) موت الخلية استنادا الفحص

DOI:

10.3791/2680

⸱

مايو 6, 2011

 ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Institute for Plant Genomics and Biotechnology, Texas A&M University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

موت الخلايا المبرمج المقايسات التي يشيع استخدامها في نظم الثدييات مثل الحمض النووي أو المقايسات laddering النفق ، وغالبا ما يصعب استنساخها في النباتات. في توليفة مع نظام مراسل GUS ، نقترح السريع ، ومحطة عابرة مقايسة يستند إلى تحليل خصائص الموت المحتملة للجينات معينة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد طورنا رواية التعبير محطة عابرة في وقت واحد يعبر عن نظام الجين المراسل ، β غلوكورونيداز (GUS) ، مع المنظمين المفترضين الإيجابية أو السلبية لموت الخلية. في هذا النظام ، N. ويترك benthamiana المشترك تسللت مع الكاسيت التي تحتوي على التعبير مدفوعة 35S الجين لتحليلها ، وناقلات GUS pCAMBIA 2301 باستخدام الأجرعية LBA4404 سلالة كوسيلة. لأن هناك حاجة الخلايا الحية للتعبير GUS تحدث ، ومن المتوقع فقدان النشاط GUS عند هذا الجين علامة المشترك مع المنظمين وأعرب الإيجابية للموت الخلية. على قدم المساواة ، وزيادة النشاط GUS لوحظ عند استخدام الجينات المضادة للأفكارك مقارنة مكافحة النواقل. كما هو مبين أدناه ، وقد استخدمنا هذا النظام بنجاح في المختبر لتحليل كل من اللاعبين المؤيدة والمناهضة للموت. وتشمل هذه المحطة لمكافحة أفكارك بي سي إل 2 المرتبطين athanoGene (BAG) عائلة ، فضلا عن المعروف محرضات الثدييات من موت الخلايا ، مثل BAX. بالإضافة إلى ذلك ، فقد استخدمنا هذا النظام لتحليل وظيفة فاة truncations محددة داخل البروتينات ، التي يمكن أن تقدم أدلة على تعديل محتمل في مرحلة ما بعد متعدية / تفعيل هذه البروتينات. هنا ، نقدم طريقة سريعة والنباتات الحساسة القائمة ، كخطوة أولية في التحقيق في وفاة وظيفة للجينات معينة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتزرع نباتات نيكوتيانا benthamiana في غرفة التحكم في درجة حرارته النمو عند 25 درجة مئوية. وتستعمل أوراق صحية موسعة تماما من النباتات القديمة 3-6 الاسبوع.

نصيحة : يمكن الحصول على أفضل النتائج باستخدام أوراق الناشئة حديثا

1. الأجرعية بروتوكول تسلل عابرة :

اليوم 1

  1. لوحات متتالية آغار LB / ريفامبيسين (25 ميكروغرام / مل) / الكانامايسين (100 ميكروغرام / مل) مع مخزون من الجلسرين المورمة الأجرعية (سلالة LBA4404) التي تحتوي على النواقل المناسبة مع الجينات (ق) إلى أن يعاير لموت الخلايا ، والتي تحتوي على النواقل الكاسيت GUS تحت المروج التأسيسية. وتشمل دائما مكافحة ناقلات فارغة كعنصر تحكم سلبية.
  2. احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 2 ايام.

اليوم 3

  1. تطعيم 2 مل من LB تحتوي ريفامبيسين (25 ميكروغرام / مل) ، والكانامايسين (100 ميكروغرام / مل) مع مستعمرة واحدة من كل رطل / ريفامبيسين / الكاناميسين وحة يشوبه سابقا.
  2. احتضان كل ثقافة عن طريق هز عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بسرعة 200 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى أقصى كثافة النمو.

ويلاحظ أحيانا التثاقل ، في حال الثقافات التي تحتاج إلى أن يكون معلق تماما (أي pipetting صعودا وهبوطا) قبل المتابعة : تلميح.

اليوم 4

  1. التالية الحضانة ، وزيادة الحجم الإجمالي إلى 10 مل مع LB الطازجة (التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة) وacetosyringone (نهائي تركيز 25 ميكرومتر).
  2. احتضان كل ثقافة عن طريق هز عند 28 درجة مئوية لمدة ساعة 16.

5 أيام

  1. في اليوم التالي يغسل كل ثقافة مرتين عن طريق إضافة 10 مل (لا تضيف acetosyringone) متوسطة التسلل (10 ملي MgSO 4 0.7 H 2 O ، MES 9 ملم ، ودرجة الحموضة 5.6) وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. بعد خطوة الطرد النهائي ، resuspend كل ثقافة في المتوسط ​​5 مل تحتوي على تسلل acetosyringone (100 ميكرومتر).
  3. قياس ل 600Nm OD ، وقياسات بين 0.1 و 0.9 مقبولة.
    نصيحة : قد استخدمت من OD ل 600Nm منخفضة مثل 0.1 دون مشكلة ، ومع ذلك ، قد تنتج المواد المستنفدة للأوزون أعلى نتائج أكثر اتساقا.
  4. احتضان الثقافات لمزيد من 3 ساعات للتحضير للثقافات الأجرعية للعدوى.
  5. خليط الثقافات التي تحتوي على الجين (ق) ليتم تحليلها ومراقبة سلبية (الأجرعية تحتوي على ناقلات الفارغة) في نسبة 1:1 مع ثقافة الكاسيت التي تحتوي على GUS.
  6. اختراق مجافي المحور (تحت) بجانب يترك الناشئة حديثا باستخدام 1 مل إبرة حقنة أقل (الشكل 1).
    نصيحة : إخترق كل من خليط السيطرة السلبية (ناقلات فارغة + GUS الكاسيت) والتي تحتوي على خليط من الجينات أن يعاير (الجينات X GUS كاسيت +) على أوراق الآخر من نفس النبات. استخدام النباتات ثلاث نسخ عن كل معاملة.
  7. تسلل 3 أيام بعد تسلل المكوس أوراق ومقايسة للتعبير البروتين GUS.

2. مقايسة النسيجية GUS

اليوم 8

  1. فراغ اختراق المتوسطة ركيزة X - الغلوكوز في أوراق استئصاله.
  2. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها أو حتى تلوين الزرقاء مميزة تظهر.

اليوم 9

  1. شطف في المياه المقطرة.
  2. احتضان في الايثانول 70 ٪ حتى تتم إزالة الكلوروفيل ، ثم نقل إلى الماء المقطر مرة أخرى. تقييم مستويات التعبير بصريا GUS.

3. Fluorometric MUG مقايسة :

اليوم 8

  1. عزل بروتين مجموع طحن أقراص أوراق تسللت في بمدافع الهاون باستخدام النيتروجين السائل. إضافة 100 UL العازلة من استخراج GUS (50 ملي NaPi الرقم الهيدروجيني 7.0 ، 10 ملي EDTA ، 0.1 ٪ تريتون X - 100 ، 0.1 ٪ N - lauroylsarcosine ملح الصوديوم ، β - المركابتويثانول (0.7 ميكروليتر / مل) مع الحفاظ على عينة على الجليد.
  2. تعليق العمل في أجهزة الطرد المركزي 14000 ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 واتخاذ طاف والبروتين الذائبة.
  3. قياس تركيز باستخدام nanodrop وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  4. ضبط تركيز البروتين إلى 100 ميكروغرام من البروتين الذائبة لكل عينة باستخدام GUS العازلة الاستخراج.
  5. إضافة الركيزة MUG (4 - methylumbelliferyl - β - D - غلوكورونيد هيدرات) التي أعدت في استخراج العازلة GUS إلى تركيز النهائي من 2 ملم. وينبغي أن يكون الحجم الإجمالي من 100 ميكرولتر لكل عينة (بروتين + الركيزة MUG) قد يكون كافيا.
  6. ردود الفعل لاحتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  7. وقف ردود الفعل من خلال إضافة 800 ميكرولتر من GUS وقف عازلة (0.2 م نا 2 CO 3).
  8. قياس مضان باستخدام قارئ لوحة في طول موجي 365 نانومتر من الإثارة وانبعاث موجة من 455 نانومتر وقارن بين القيم إلى منحنى معيارا MU. تقرير مستويات النشاط وGUS مجموع MU / ميكروغرام nmol ذوبان البروتين / دقيقة.

4. الأسهم والحلول :

  1. Acetosyringone (1 م) سهم (FW = 196.2 ز) الفرعي> -- 0.981 غرام في 5 مل من DMSO
  2. الكانامايسين (100 ملغ / مل) المخزون -- إعداد درهم في 2 0 -- فلتر تعقيم
  3. ريفامبيسين (25 ملغ / مل) المخزون -- إعداد في DMSO
  4. لوريا ، Bertani النمو السائل (LB) وسائل الإعلام : (1L)
    1 ٪ (W / V) bacto - تريبتون ، 10 ز
    0.5 ٪ (W / V) bacto ، خلاصة الخميرة ، 5 ز
    170 كلوريد الصوديوم 10 مم ز
    الحموضة -- 7
  5. Acetosyringone (25 ميكرومتر) = 25 ميكرولتر من مخزون M 1 في النهائي لحجم 1 مل
  6. متوسطة تسلل : (1L)
    10 ملي MgSO 4 2 0 0.7 درهم (FW = 246،48 ز) و 2.4648 ز
    9 ملم زارة التربية والعلم (FW = 213،25 ز) ، 1.91925 ز
    الحموضة -- 5.6
  7. Acetosyringone (100 ميكرومتر) = 100 ميكرولتر من مخزون 1M في الحجم النهائي من 1 مل
  8. GUS استخراج الاحتياطي
    50 ملي NaPi الرقم الهيدروجيني 7.0 ، 10 ملي EDTA ، 0.1 ٪ تريتون X - 100 ، 0.1 ٪ N - lauroylsarcosine ملح الصوديوم ، β - المركابتويثانول (0.7 ميكروليتر / مل)
  9. 2X الفوسفات عازلة
    ناه 0.2M 2 ص 4 و 0.2 م 2 نا هبو 4 درجة الحموضة 7
  10. X - الحلاوة ركيزة الحل
    حل 1 ملغ من 5 - 4 - برومو كلورو - 3 - BD - indolyl غلوكورونيد (X - الغلوكوز) في الميثانول مل 0.1. إضافة 1 مل من الفوسفات 2X العازلة ، 20 ميكرولتر فيري سيانيد البوتاسيوم 0.1M ، 10μl تريتون X - 100 10 و 850 ٪ من المياه المقطرة ميكرولتر.

5. ممثل النتائج :

بعد هذا البروتوكول ، ومن المتوقع فقدان التعبير GUS عندما يحدث موت الخلايا. أعربنا في الوقت نفسه على الجين المراسل ، β غلوكورونيداز (GUS) مع أحد أعضاء Arabidopsis خلوي واقية بي سي إل 2 المرتبطين athanoGene (BAG) الأسرة. شاركنا في تسلل N. benthamiana يترك مع 35S مدفوعة BAG الكاسيت التعبير وناقلات GUS pCAMBIA 2301 باستخدام الأجرعية LBA4404 السلالة. وكما هو مبين في الشكل 2 ، لاحظ زيادة ملحوظة في تلطيخ GUS بعد هذا التسلل. على العكس ، عندما كان يعرف الموالي لأفكارك عضوا من عائلة بي سي إل 2 استخدمت BAX ، لوحظ انخفاض ملحوظ في تلطيخ GUS (الشكل 2). في كل حالة من هذه الحالات ، كانت مختلفة بشكل واضح GUS التعبير بالمقارنة مع السيطرة. ومع ذلك ، عند الاختلاف في التعبير هو أقل وضوحا ، يمكن إجراء فحوصات MUG fluorometric لquanitate GUS التعبير.

figure-protocol-1
الشكل 1. مثال على مزيج الأجرعية تسلل من الجانب مجافي المحور ن. benthamiana يترك باستخدام 1 مل إبرة حقنة أقل.

figure-protocol-2
الشكل 2. وكان شارك في ناقلات GUS التي أعرب عنها في ن. benthamiana يترك مع الجينات المضادة للموت ، ومحفز معروف من موت الخلية. وتمت مقارنة مستويات GUS لمكافحة ناقلات فارغة (GUS التحكم).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما يكون من الصعب استخدام تقنيات الكشف عن خلية الموت في النباتات التي هي مشتركة في نظم الثدييات. في توليفة مع نظام مراسل GUS ، نقدم محطة يستند إلى طريقة حساسة لاكتشاف وتحليل اللاعبين موت الخلية. هذا الأسلوب يستفيد من حقيقة بسيطة وهي أن هناك حاجة الخلايا الحية للتعبير عن المكتب المركزي للاحصاءات أن تحدث. لضمان تحقيق نتائج ذات مغزى والتكرار ، فمن الأهمية بمكان أن يتم اختراق الثقافات إيواء الكاسيت GUS والجينات أن يعاير في نسب متساوية. ينبغي الحفاظ على هذه النسب عند مقارنة إضافية موت الخلايا المحتملة لاعبين. كما هو ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات (اختياري)
ريفامبيسين VWR IC19549001 25mg/mL الأسهم في DMSO
4' هيدروكسي 3 '، 5' - dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) VWR TCD2666 0.981 غرام / مليلتر في DMSO (1M الأسهم)
2 -- (4 - morpholino) مونوهيدرات حامض ethanesulfonic (MES) VWR EM - 6110 1.92 غرام / لتر في الماء لجعل 1 لتر من وسائل الإعلام تسلل
Bacto - تريبتون الصياد BP1421 - 2 10G / لتر في الماء لجعل 1 لتر من المتوسط ​​LB
Bacto ، خلاصة الخميرة VWR EM1.03753.0500 5G / لتر في الماء لجعل 1 لتر من المتوسط ​​LB
كلوريد الصوديوم VWR EM - 7710 10G / لتر في الماء لجعل 1 لتر من المتوسط ​​LB
مونوهيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة VWR MK - 7868-12 2.5G / لتر في الماء لصنع 50mM من NaPi العازلة
ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم heptahydrate VWR EMD - SX0715 - 1 5G / لتر في الماء لصنع 50mM من NaPi العازلة
سلفات المغنيزيوم heptahydrate VWR EM - MX0070 - 1 2.5 غرام / لتر في الماء لجعل 1 لتر من وسائل الإعلام تسلل
N - Lauroylsarcosine VWR TCL0151 - 500G 0.1 ٪ V / V عازلة في GUS
5 - 4 - برومو كلورو - 3 - إندوكسيل بيتا - D - غلوكورونيد الملح cyclohexylammonium (X - الحلاوة) الذهب التكنولوجيا الحيوية G1281C 1mg/100uL في الميثانول 100 ٪
- 4 - Methylumbelliferyl μ - D - غلوكورونيد هيدرات (القدح) سيغما M5664 2 مم في 100 UL العازلة من استخراج GUS
فيروسيانيد البوتاسيوم هيدرات VWR EM - PX1460 - 1 100mM الأسهم عن حل الركيزة X - الحلاوة
β - Methylumbelliferone (MU) سيغما الدريخ M1381 MU لاستخدام منحنى القياسية العازلة استخراج GUS
كربونات الصوديوم VWR EM - SX0395 - 11 0.2 M في الماء لصنع GUS وقف العازلة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
  2. Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
  3. Hodal, L. Plant Science. 87, 115-115 (1992).
  4. Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
  5. Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
  6. Yan, J. Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
  7. Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
  8. Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
  9. Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
  10. Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GUS Agrobacterium Nicotiana Benthamiana 35S GUS

مقالات ذات صلة