وقد وضعت وصمة فتحة بسيطة طريقة لتقدير حجم راصة دموية الأنفلونزا الفيروسية والنيورامينيديز باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف الجميع متواليات الأكثر حفظا تم تحديدها من خلال تحليل المعلومات البيولوجية. قد يكون هذا النهج المبتكرة توفر بديلا مفيدا لتحديد الكمي للجميع راصة دموية الفيروسية والنورامينيداز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نوع التحاليل الكمية للجميع الأنفلونزا من Hemagglutinins الفيروسية وNeuraminidases باستخدام الاجسام المضادة العالمي في فتحة بسيطة فحوصات لطخة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
راصة دموية (HA) والنورامينيداز (NA) واثنين من البروتينات السطحية فيروسات الانفلونزا التي هي معروفة للعب أدوار مهمة في دورة الحياة الفيروسية وتحريض واقية 1،2 الاستجابات المناعية. والهدف الرئيسي لتحييد الأجسام المضادة ، ويستخدم حاليا HA باعتبارها قوة علامة لقاحات الأنفلونزا ويقاس بواسطة المناعي الشعاعي واحد (SRID) 3. ومع ذلك ، فإن اعتماد SRID على توافر الأمصال الضدية المقابلة سلالة معينة يؤدي إلى الحد الأدنى من 2-3 أشهر من التأخير من اجل الافراج عن كل لقاح جديد. علاوة على ذلك ، على الرغم من الأدلة التي NA يدفع أيضا مناعة وقائية 4 ، ومبلغ NA في لقاحات الأنفلونزا ليست موحدة حتى الآن بسبب عدم وجود الكواشف التحليلية المناسبة أو الأسلوب 5. وهكذا ، وطرق بديلة قادرة على تحديد كمية بسيطة HA و NA المستضدات المرغوب فيه الإفراج السريع ، وتحسين مراقبة جودة لقاحات الأنفلونزا.
وقد تم تحديد مناطق الحفظ عالميا في جميع الأنفلونزا A HA المتاحة ومتواليات بواسطة NA التحليلات المعلوماتية الحيوية 6-7. وقد تم تحديد سلسلة واحدة (تسمى يوني - 1) في حاتمة فقط الحفظ عالميا HA ، والانصهار الببتيد 6 ، في حين تم التعرف على اثنين من متواليات المحفوظة في neuraminidases ، واحدة بالقرب من موقع نشط الأنزيمية (تسمى HCA - 2) و أخرى على مقربة من محطة - N (تسمى HCA - 3) 7. وتوليفها مع هذه الببتيدات تسلسل الأحماض الأمينية وتستخدم لتحصين الأرانب لإنتاج الأجسام المضادة. والجسم المضاد ضد حاتمة يوني - 1 هكتار قادرة على ربط إلى 13 ألف هكتار من الأنواع الفرعية (H1 - H13) في حين أن الأجسام المضادة أنفلونزا ضد HCA - 2 - 3 وHCA مناطق NA كانت قادرة على ربط جميع NA 9 أنماط فرعية. وأظهرت جميع الأجسام المضادة ضد خصوصية ملحوظة في تسلسل الفيروسي كما يتضح من ملاحظة أن تم الكشف عن أي عبر تفاعل البروتينات إلى السقاء. ثم استخدمت هذه الأجسام المضادة عالمية لتطوير المقايسات صمة فتحة لقياس HA و NA في لقاحات الأنفلونزا دون الحاجة للأمصال مضادة محددة 7،8. وطبقت على عينات لقاح غشاء PVDF باستخدام جهاز لطخة فتحة مع المعايير المرجعية المخفف لتركيزات مختلفة. للكشف عن HA ، تم تخفيفه واول عينات قياسية في تريس - مخزنة المالحة (TBS) التي تحتوي على اليوريا في حين 4M لقياس NA أنها كانت مخففة في TBS تحتوي على 0.01 ٪ كما Zwittergent هذه الظروف تحسنت بشكل ملحوظ لحساسية الكشف. في أعقاب الكشف عن المستضدات وHA NA بواسطة immunoblotting مع الأجسام المضادة على الصعيد العالمي منها ، وكانت إشارة من كميا شدة كثافة. ثم حسبت كميات من HA و NA في اللقاحات باستخدام منحنى القياسية التي أقيمت مع شدة إشارة لتركيزات مختلفة من المراجع المستخدمة.
بالنظر إلى أن هذه الأجسام المضادة ربط الحواتم العالمية في HA أو NA ، يمكن للمحققين المهتمة استخدامها كأدوات بحث في المناعية الأخرى من لطخة فتحة فقط.
البروتوكول
1. إعداد الكواشف والمعدات
- قبل البدء في إجراء فتحة لطخة ، وإعداد 20_mls من محلول اليوريا في تريس - 4M مخزنة المالحة Zwittergent (TBS) لراصة دموية ، أو HA ، لطخة فتحة ، أو 20_mls من 0.01 ٪ (20 ملي تريس و 137 ملي مول كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.6) الحل في لTBS النورامينيداز ، أو NA ، لطخة الفتحة. في حين ينبغي أن نكون مستعدين اليوريا 4M جديدة في كل مرة ، وهو 10 ٪ في محلول المخزون Zwittergent درهم 2 O ثابت لمدة 6 أشهر على الأقل في درجة حرارة الغرفة وبالتالي يمكن تخفيفه إلى 0.01 ٪ في TBS قبل كل فحص.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحديد كمي لHA الأنفلونزا الفيروسية وNA بالغة الأهمية بالنسبة لبحوث اللقاحات والتنمية منذ هذه البروتينات السطحية هما أهم عناصر فيروسية حفز الاستجابات المناعية 6-11. الطرق المناعية ذكرت سابقا للكشف عن هذه البروتينات الأجسام المضادة تتطلب سلالة معينة. وصمة فتحة بسيطة ومتكررة وطريقة سريعة لتحديد المستضدات HA و NA الموصوفة هنا هي مناسبة لجميع فيروسات الإنفلونزا A HA وبروتين NA الأضداد منذ الاعتراف بها عالميا الحواتم فقط الحفظ 6-8. ربما لصعوبة الوحيد للمحققين المهت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر السيدة مونيكا Tocchi لمراجعة تحريرية للمخطوطة. ويدعم AMH بواسطة منحة من جامعة الملك عبدالعزيز ، عن طريق المكتب الثقافي السعودي في كندا العربي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف أو المعدات | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| النقطة الحيوية جهاز SF الدقيق | الحيوي راد | 170-6542 | |
| النقطة الحيوية ورقة تصفية SF | الحيوي راد | 162-0161 | |
| Immobilon - FL نقل غشاء (PVDF) | ميليبور | IPFL00010 | |
| فراغ مضخة | ميليبور | WP6111560 | |
| فيلم لمعان كيميائي BioMax الخفيفة | الة ألتصوير اليدوية | 178 8207 | |
| FluorChem النظام جل الوثائق | ألفا Innotech | 29-008 - 1896X | |
| الأضداد الأرنب العالمي ضد HA ومستضدات NA | UNI - 1 (HA) HCA - 2 ، HCA - 3 (NA) | الأضداد متاحة من خلال MTA أو يمكن توليدها من قبل المحققين المهتمين وفقا للإجراءات التي سبق وصفها 6،7. | |
| لقاح الانفلونزا مستضد المرجعية | CBER / FDA أو NIBSC | ||
| عينات من لقاحات الأنفلونزا | تتوفر عادة في معظم البلدان | ||
| اليوريا | سيغما الدريخ | U1250 | |
| Zwittergent 14/03 منظفات | Calbiochem | 693017 | |
| توين - 20 | فيشر العلمية | BP337 - 500 | |
| النشاف الصف حظر غير دهن الحليب الجاف | الحيوي راد | 170-6404 | |
| ImmunoPure الماعز المضادة للأرنب IgG و (H + L) ، مترافق البيروكسيداز | الحرارية العلمية | 31460 | |
| الموسعة SuperSignal الغربية الدرة الركيزة المدة | الحرارية العلمية | 34075 |
المراجع
- Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
- Wood, J. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays
Posted by JoVE Editors on 11/13/2012. Citeable Link.
An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.
