طريقة فعالة من حيث التكلفة لتعقب مصدر الميكروبات عن طريق محددة الفيروسات البشرية والحيوانية

Summary

دراسة توضح طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحديد مصدر تلوث برازي / البول أو التلوث النترات في المياه باستخدام qPCR الكمي للفيروسات محددة من الحمض النووي البشري / الخنزير / البقر ، والفيروسات الغدية polyomaviruses ، على النحو المقترح أدوات MST.

Abstract

التلوث الميكروبي للبيئة يمثل مخاطر صحية كبيرة. المؤشرات البكتيرية الكلاسيكية البراز أظهرت أن يكون لها حدود كبيرة ، والفيروسات وأكثر مقاومة للكثير من عمليات التعطيل والمؤشرات القياسية البراز لا تبلغ عن مصدر التلوث. تطوير أساليب فعالة التكلفة للتركيز الفيروسات من الماء والمقايسات الجزيئية يسهل انطباق الفيروسات كمؤشرات للتلوث البراز والجراثيم كمصدر تتبع الأدوات (MST). والفيروسات الغدية polyomaviruses هي فيروسات تصيب الحمض النووي الأنواع الفقارية محددة بما في ذلك البشر وتفرز بشكل مستمر في البراز و / أو البول في جميع المناطق الجغرافية التي شملتها الدراسة. في الدراسات السابقة ، واقترح علينا تحديد مقدار الفيروسات الغدية البشرية (HAdV) وpolyomaviruses JC (JCPyV) بواسطة PCR الكمي (qPCR) وذلك في مؤشر تلوث البراز البشري. في الآونة الأخيرة ، وضعنا لفحوصات qPCR الكمي محددة من البرتغالالفيروسات الغدية سينمائية (PAdV) وpolyomaviruses البقري (BPyV) كدلالة على وجود تلوث برازي الحيوانات ذات حساسيات من نسخ الجينوم 10-10 في أنبوب اختبار. في هذه الدراسة ، فإننا نقدم الإجراءات الواجب اتباعها لتحديد مصدر تلوث في عينات المياه باستخدام هذه الأدوات. ومثال على نتائج ممثلة ، يظهر تحليل الفيروسات في المياه الجوفية تقديم مستويات عالية من النترات.

الكشف عن الفيروسات في المياه الملوثة منخفضة أو متوسطة يتطلب تركيز الفيروسات ما لا يقل عن عدة لترات من الماء إلى حجم أصغر بكثير ، وهو الإجراء الذي عادة ما يتضمن الخطوات تركيز اثنين في السلسلة. هذا الإجراء مرهقة بعض الشيء ، والتباين الملحوظ في استرداد الفيروسي يعيق بشكل كبير في تجهيز المتزامن لعدد كبير من عينات المياه.

من أجل القضاء على عنق الزجاجة بسبب الإجراءات على مرحلتين لدينا تطبيق البروتوكول خطوة واحدة وضعت في السابق studieق ، وتنطبق على مجموعة متنوعة من المصفوفات المياه. الإجراء يشمل : تحمض عينات من المياه لمدة عشر لتر ، تندف من الحليب الخالي من الدسم ، والترسيب خطورة المواد flocculated ، وجمع من تعجل والطرد المركزي ، إعادة تعليق من يعجل في 10 مل العازلة الفوسفات. يتم استخدام تركيز الفيروسي لاستخلاص الأحماض النووية الفيروسية والفيروسات الغدية محددة وpolyomaviruses من الفائدة التي qPCR كميا. قد يكون عدد كبير من العينات التي تم تحليلها في وقت واحد باستخدام هذا الأسلوب تركيز منخفض التكلفة.

وقد تم تطبيق هذا الإجراء لتحليل مياه الاستحمام ومياه البحر ومياه النهر وفي هذه الدراسة ، فإننا نقدم نتائج تحليل عينات المياه الجوفية. هذا الأسلوب الإنتاجية العالية الكمية هو موثوق بها ومباشرة وفعالة من حيث التكلفة.

Protocol

1. تركيز الجسيمات الفيروسية موجودة في عينات المياه

1. وتكييف جمع عينات المياه
   1. جمع ما لا يقل عن 2 لتر من 10 مكررات لكل عينة في حاويات من البلاستيك مع مسطحة القاع وعينة واحدة اضافية كعنصر تحكم العملية. وسيتم ارتفعت هذه العينة الأخيرة مع كمية معروفة من الجزيئات الفيروسية ويستخدم كعنصر تحكم.
      ملاحظة : من المستحسن أن يكون مادة مستقلة خاصة (الزجاجات والأنابيب وغيرها) لعينات ارتفعت.
   2. تحقق من معايرة مقياس التو....

Discussion

ووصف الإجراء استيفاء الشروط اللازمة للأسلوب المناسب لروتين مختبرات البيئة والصحة العامة : يمكن استنساخه ، موثوق بها ، واضحة وفعالة من حيث التكلفة. بروتوكول بسيط ، ولكن يجب اتباعها بعناية. والموصلية المنخفضة في العينات دون إضافة تركيز الأملاح المطلوبة من مياه البحر الاصطناعي الحد بشكل كبير من الانتعاش من الفيروسات كما سيكون عليه الحال إذا ما تم الحد بشكل كبير من الوقت لاثارة التلبد (أقل من 5 ساعات على سبيل المثال).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
الطرد المركزي عالية السرعة (8000 x ج)	Berckman كولتر	أفانتي J - 20XP
درجة الحموضة متر ، ومقياس الحرارة مقياس التوصيل	Afora	LPPC3003
أنابيب بلاستيكية طولها 100-200 سم	Deltalab	350059
تخرج عقيمة ماصات المتاح	Labclinics	PN10E1
أنابيب بلاستيكية معقمة 1.5 و 10-15 مل (إيبندورف ، الصقور ، الخ.)	Afora	KA298/00
الأواني الطرد المركزي (500 مل)	فيشر العلمية	SE5753512
النمامون المغناطيسي والمغناطيس (واحدة لكلالعينة)	فيشر العلمية	10510
الزجاج أو البلاستيك قيعان الحاويات وجود شقة للسماح للاستخدام النمامون المغناطيسي	Deltalab	191642
مضخة تمعجية لإزالة طاف (أو فراغ مضخة مائية نفاثة)	واتسون ، مارلو	323E / D
الموقت إلى التحول بعيدا عن اثارة بعد 8-10 ساعات	Deltalab	900400
حمض الهيدروكلوريك (1N و0.1N)	Panreac	141020.1611
هيدروكسيد الصوديوم (1N)	Panreac	131687.1211
أملاح البحر الاصطناعي مياه البحر	سيغما	S9883
الحليب الخالي من الدسم (SM)	Difco	232100
الفوسفات الحموضة العازلة 7(5)			01:02 ت / ت 2 من العقيمة نا هبو M 4 و 0،2 ناه 2 ص 4 0،2 م عند pH 7.5
Thiosulphate	Panreac	121879.1209	جعل حل 10 ٪ في الماء
QIAamp الفيروسي RNA ميني كيت	Qiagen	52904
96 - جيدا رد فعل لوحة بصرية (500 وحدة)	تطبيق النظم البيولوجية	43426659
لاصق يغطي البصرية (100 وحدة)	تطبيق النظم البيولوجية	4311971
TaqMan PCR البيئية ماجستير ميكس 2X	تطبيق النظم البيولوجية	4396838