Method Article

تحليل فسيفساء من وظائف الجينات في الدماغ بعد الولادة ماوس التنمية عن طريق استخدام فيروس لجنة المساواة العرقية القائمة على التوحد

DOI:

10.3791/2823

August 1st, 2011

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

و في الجسم الحي طريقة لاختبار وظيفة الجين في الدماغ بعد الولادة. يتم حقن AAVs المؤتلف معربا عن لجنة المساواة العرقية و / أو بروتين فلوري في مخ الفأر الولدان. وتتحقق الفسيفساء تعطيل الجينات ووضع العلامات العصبية متناثر ، مما يسمح التحليل السريع وظيفة الجين في العمليات الحرجة للتنمية الدوائر العصبية.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وظيفة الدماغ طبيعي يعتمد ليس فقط على التطور الجنيني عندما يتم تأسيس المسارات العصبية الرئيسية ، ولكن أيضا على التنمية ما بعد الولادة عندما نضجت الدوائر العصبية وصقلها. قد Misregulation في هذه المرحلة يؤدي إلى اضطرابات عصبية ونفسية مثل التوحد وانفصام الشخصية 1،2. وقد تم دراسة العديد من الجينات في الدماغ قبل الولادة وجدت حاسمة لكثير من العمليات التنموية 3-5. ومع ذلك ، فإن وظيفتها في الدماغ بعد الولادة غير معروف إلى حد كبير ، ويرجع ذلك جزئيا الحذف في الفئران غالبا ما يؤدي إلى الفتك التنمية خلال حديثي الولادة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى ما يتطلبه المبكر يعيق التنمية في تحليل ما بعد الولادة. للتغلب على هذه العقبات ، ويتم حاليا الأليلات floxed من هذه الجينات في الفئران التي يتم توليدها 6. عندما يقترن الأليلات المعدلة وراثيا التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية recombinase في أنواع معينة من الخلايا ، ويمكن تحقيق الحذف مشروط لدراسة وظائف الجينات في الدماغ بعد الولادة. ومع ذلك ، يتطلب هذا الأسلوب الأليلات إضافية والوقت الاضافي (3-6 أشهر) لتوليد الفئران مع المورثات المناسبة ، مما يحد من التوسع في التحليل الوراثي على نطاق واسع في مخ الفأر.

نحن هنا يبرهن على وجود نهج متكامل يستخدم لجنة المساواة العرقية فيروسي ، وأعرب لدراسة هذه الأليلات floxed بسرعة وبشكل منهجي في تطور الدماغ بعد الولادة. عن طريق حقن الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسات (rAAVs) 7،8 الترميز لجنة المساواة العرقية في الدماغ حديثي الولادة ، ونحن قادرون على حذف هذا الجين من الاهتمام في مناطق مختلفة من الدماغ. من خلال التحكم في عيار الفيروسية وcoexpressing علامة بروتين فلوري ، في وقت واحد يمكن أن نحقق الفسيفساء تعطيل الجينات ووضع العلامات العصبية متفرق. هذا الأسلوب يتجاوز متطلبات التنمية في العديد من الجينات في وقت مبكر ، ويسمح لنا لدراسة الخلايا وظيفتها الحكم الذاتي في العديد من العمليات الحرجة في نمو المخ بعد الولادة ، بما في ذلك النمو محواري والجذعية ، والمتفرعة ، والتبليط ، وكذلك تشكيل المشبك والصقل. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح في المختبر منطقتنا (نتائج غير منشورة) وغيرهم 8،9 ، ويمكن أن تمتد إلى غيرها من الفيروسات ، مثل الفيروسة البطيئة 9 ، فضلا عن التعبير عن shRNA أو البروتينات النشطة المهيمن 10. علاوة على ذلك ، من خلال الجمع بين هذه التقنية مع الكهربية وكذلك في الآونة الأخيرة نموا أدوات التصوير الضوئي 11 ، هذا الأسلوب يقدم استراتيجية جديدة لدراسة كيفية تأثير العصبية الوراثية مسارات التنمية الدوائر وظيفة في الفئران والجرذان.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التحضير للحقن الفيروسات

  1. تم شراؤها من بائع rAAVs التجارية الموصى بها ، ولكن يمكن أيضا أنها لن تنتج في معمل المرء (انظر المناقشة أدناه). وينتج عادة الفيروس في حل من عيار 1x10 ~ 12 نسخ الجينوم في الملليمتر الواحد (GC / مل) ، ويمكن استخدامه في عيار الكامل لمعالجة عدد كبير من الخلايا. بدلا من ذلك ، قد تكون مخففة عليهم تنتج المستوى المطلوب لوضع العلامات متفرق. يجب أن يتحدد في تخفيف مناسبة من قبل المستخدم ، ولكن ينصح المخفف 01:10 لبدء.
  2. ذوبان الجليد وجود فيروسات على الفور قبل استخدام....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والولدان طريقة الحقن الفيروسية المعروضة هنا يوفر وسيلة بسيطة وسريعة لتوليد الفسيفساء في الجسم الحي لدراسة تطور الدماغ بعد الولادة. الأسلوب يستفيد من الأليلات floxed المتوفرة حاليا فضلا عن تلك التي تبذل من خلال الجينات إنتاجية عالية استهداف المشروع 6. بالمقارنة مع استخدام تعبير المعدلة وراثيا من لجنة المساواة العرقية ، وهذه الطريقة توفر طريقة سريعة لاختبار وظائف الجينات في مختلف أنواع الخلايا ، كما يمكن استخدام الفئران التي تحمل صبغيات floxed مباشرة للتجارب ، وإ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة RO1 (NINDS).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات (اختياري)
rAAV8 - لجنة المساواة العرقية ، GFP - ، - DsRed ، ناقلات Biolabs # 7060 ، # 7061 ، والنظام مخصص http://www.vectorbiolabs.com
جامعة هارفارد 11 مضخة بلس جهاز هارفارد # 702208 (لا يوجد منفذ دواسة القدم)
الشبكية حقن صبغات الطلائية كيت العالم آلات دقيقة RPE - KIT يحتوي الضام الإبر أنابيب الحقن ، (36G) ، وحامل إبرة
NanoFil الحقنة ، 100μl العالم آلات دقيقة NANOFIL - 100 وتشمل إعادة الاستخدام إبرة التحميل
D - PBS Invitrogen 14040-117
GFP الأضداد أفيس GFP - 1020
DsRed الأضداد Clontech 632496
بلوك التدفئة VWR 97042-610
ROSA26R الماوس مختبر جاكسون 003309

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
  2. Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we goin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mosaic AnalysisVirus based Cre RecombinationPostnatal Brain DevelopmentConditional Gene DeletionAdeno associated Virus InjectionFluorescent Protein LabelingImmunofluorescence MicroscopyNeural Circuit DevelopmentAxonal Dendritic GrowthSynapse Formation Refinement

Related Articles