Method Article

تحضير وتنقية وتوصيف انثانيد المجمعات للاستخدام وكلاء والتباين للتصوير بالرنين المغناطيسي

DOI:

10.3791/2844

⸱

July 21st, 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wayne State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نبدي metalation ، والتنقية ، وتوصيف المجمعات اللانثينيدات. يمكن للمجمعات وصفها هنا لتكون الجزيئات مترافق لتمكين تتبع هذه الجزيئات باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشيع استخدام Polyaminopolycarboxylate المستندة يغاندس إلى أيونات انثانيد كلاب ، والمجمعات الناتجة مفيدة كعوامل النقيض من التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). العديد من يغاندس المتاحة تجاريا مفيدة خصوصا لأنها تحتوي على المجموعات الوظيفية التي تسمح لسرعة ونقاء عالية ، وذات العائد المرتفع لاقتران الجزيئات والجزيئات الحيوية عبر أمين التفاعل استرات المنشط والجماعات أو ثيوسيانات maleimides ثيول التفاعل. ويجب في حين تعتبر هذه metalation يغاندس المعرفة المشتركة في مجال الكيمياء bioconjugation ، والاختلافات الطفيفة في إجراءات metalation أن تؤخذ بعين الاعتبار عند اختيار المواد المعدنية انطلاق. وعلاوة على ذلك ، وخيارات متعددة لتنقية وجود توصيف واختيار الإجراء الأكثر فعالية يعتمد جزئيا على اختيار المواد الأولية. وغالبا ما تهمل هذه الاختلافات الطفيفة في البروتوكولات التي تم نشرها. هنا ، وهدفنا هو إظهار الطرق الشائعة لmetalation ، والتنقية ، وتوصيف انثانيد المجمعات التي يمكن استخدامها كعامل النقيض لتصوير بالرنين المغناطيسي (الشكل 1). ونحن نتوقع أن هذا المنشور سيمكن علماء الطب الحيوي لدمج ردود الفعل complexation انثانيد في ذخيرتهم من ردود الفعل شيوعا عن طريق تخفيف اختيار المواد الأولية وطرق تنقيتها.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Metalation باستخدام أملاح LnCl 3

  1. حل ليجند في الماء لإنتاج حل 30-265 ملم. وقد استخدم (4 - isothiocyanatobenzyl) - diethylenetriamine pentaacetic حمض (ف SCN - BN - DTPA) في هذا الفيديو عند تركيز من 73 مم -- ليجند 2.
  2. ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل ليجند من بين 5.5 و 7.0 عن طريق إضافة 1 م NH 4 OH. في هذا الفيديو ، كانت تستخدم 0.2 مل من محلول 1 M NH 4 OH.
  3. حل المعادلات من 1-2 LnCl 3 في الماء لإنتاج حل مع تركيز 5000-1000 مم. في هذا الفيديو ، واستخدمت EuCl 3 و 3 في GdCl تركيزات من 111 ملم. وكثيرا ما يستخدم وجود فائض من المعدن لدفع metalation على الانتهاء وبالتالي تبسيط تنقية.
  4. إضافة حل LnCl 3 إلى حل يجند مع التحريك.
  5. بعد إضافة LnCl 3 ، وضبط درجة الحموضة من خليط التفاعل الناجم عن ذلك بين 5.5 و 7.0 عن طريق إضافة 0.2 M NH 4 OH. تم استخدام ما مجموعه 0.5 مل من محلول 0.2 M NH 4 OH في هذا الفيديو. إذا كان يجند الخاص يحتوي على حمض حساسة المجموعات الوظيفية ، وتعديل درجة الحموضة مرات متعددة خلال هذه الخطوة. تحذير -- إذا حل يصبح الأساسية جدا ، أي قاعدة المجموعات الوظيفية الحساسة ، مثل ثيوسيانات ، سيتم تقديم غير قابل للاستخدام الاقتران.
  6. رصد رد فعل عن طريق قياسات الحموضة. رد الفعل عند اكتمال الأس الهيدروجيني تبقى ثابتة.

2. رفع درجة الحموضة workup (غير المدرجة في هذا الفيديو ، ولكن جيدة ليغاندس بدون قاعدة تراعي الفئات الوظيفية)

  1. إضافة NH 4 OH تتركز على خليط التفاعل لضبط درجة الحموضة إلى ≥ 11. وسوف يعجل هذه الخطوة أي معدن uncomplexed مثل هيدروكسيد المستعصية.
  2. تصفية طاف عبر مرشح ميكرومتر 0.2. ويوصى إذا كان خليط التفاعل يسد التصفية ، والطرد المركزي الصب قبل التصفية.
  3. إذا لن يتم تنفيذ غسيل الكلى ، وإزالة المذيب تحت الضغط المخفض (التبخير الدوار أو من المستحسن تجفيف تجميد).
  4. ويمكن تكرار الخطوات 2،1-2،3 انثانيد مجانا إذا لا يزال قائما.

3. غسيل الكلى workup

  1. قطع أنابيب غسيل الكلى لمدة مناسبة (اتبع المبادئ التوجيهية للالمصنع) لعقد حجم العينة في حين ترك طول اضافية (نحو 10 ٪ من حجم العينة). في هذا الفيديو ، استخدمت 100-500 دالتون الوزن الجزيئي قطع (MWCO) الغشاء ، ولكن يمكن استخدام أنابيب أكبر MWCO حسب مقتضى الحال إذا تم تنفيذ الاقتران قبل metalation. أيضا ، يمكن استخدام الأشرطة غسيل الكلى كبديل للأنابيب غسيل الكلى اذا شئت.
  2. إذا كان ذلك مناسبا على أساس المبادئ التوجيهية للمصنع ، وتنقع قطع أنابيب غسيل الكلى في الماء لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة.
  3. ملء خزان غسيل الكلى (كان يستخدم كوب L 1 في هذا الفيديو) مع الماء (ديالة). وينبغي أن يكون حجم ديالة 100X أن ما يقرب من العينة.
  4. حظيرة واحدة من نهاية الأنبوب مرتين وتأمين جزء من الأنبوب مطوية مع غسيل الكلى المشبك الإغلاق. التفاف نهاية الاغلاق مع الشريط المطاطي لضمان أن تبقى مغلقة أثناء الغسيل الكلوي.
  5. تصفية خليط التفاعل من خلال مرشح 0،2 ميكرون ، وتحميل الترشيح في نهاية مفتوحة للأنابيب والحرص على عدم تمزق الأنبوب. تأكد من ترك مساحة كافية على رأس لإغلاق الأنبوب.
  6. أضعاف نهاية المتبقية مفتوحة للأنابيب مرتين ، آمنة مع الإغلاق ، والتفاف على الحصار مع الشريط المطاطي كما في الخطوة 3.4.
  7. نعلق قارورة زجاجية تحتوي على الهواء لالمشبك على واحدة من نهاية الأنبوب غسيل الكلى باستخدام الشريط المطاطي. نعلق قارورة تحتوي على الرمل لالمشبك الأخرى. هذه القوارير ضمان أن يبقى مغمورة الأنبوب في ديالة.
  8. وضع أنابيب كامل في الخزان الذي يحتوي على غسيل الكلى ديالة.
  9. تحريك ديالة باستخدام لوحة تحريك مغناطيسي بسرعة بطيئة (أي vortexing) عند درجة حرارة الغرفة.
  10. تغيير ديالة 3X على مدى يوم واحد (في هذا الفيديو ، تم تغيير عند 2.5 ديالة ، 6.5 ، 11.5) و (ح) ، ثم السماح بمواصلة غسيل الكلى بين عشية وضحاها (أي ما مجموعه 20-28 ساعة من الغسيل الكلوي).
  11. إزالة أنابيب غسيل الكلى من ديالة وفتح بعناية one إغلاق لإزالة العينة. غسل أنابيب غسيل 3X مع الماء والجمع بين الغسيل مع العينة.
  12. إزالة المياه تحت ضغط منخفض. يستخدم تجميد التجفيف في هذا الفيديو.

4. تقييم وجود المعادن مجانا

  1. حل مجمع المعادن العازلة في خلات (إعداد العازلة : يذاب 1.4 مل من حمض الخليك في الماء 400 مل ، وضبط درجة الحموضة إلى 5.8 مع 1 M NH 4 OH ، وإضافة الماء لإنتاج وحدة تخزين ما مجموعه 500 مل) ، وإضافة زايلينول المؤشر البرتقالي (16 ميكرومتر في المخزن المؤقت 5.8 درجة الحموضة). في هذا الفيديو ، تم حل 0،3 ملغ من التعقيد في 0.3 مل من العازلة ، وتمت إضافة 3 مل من محلول المؤشر.
  2. كشف عن وجود معدن مجانا عبر مراقبة تغير لون المؤشر من اللون الأصفر إلى اللون البنفسجي.
  3. إذا رغبت في ذلك ، يمكن كميا كمية من المعدن مجانا عن طريق إنشاء منحنى المعايرة 1. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام صبغة arsenazo الثالث بدلا من البرتقال زايلينول 2. إذا كان المعدن لا تزال حرة ، يجب أن تكون العينة تنقيتها باستخدام مزيد من غسيل الكلى ، وعمود تحلية ، أو عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) قبل التوصيف.

5. تقرير المياه والتنسيق رقم (ف)

  1. يعد حل ثالثا في الاتحاد الأوروبي التي تحتوي على مجمع (~ 1 ملم) في H 2 O وحل آخر للتركيز في نفس D 2 O. قبل التحليل ، لا بد من حل تبخرت D O (2) وحلت في D 2 O ثلاث مرات لإزالة بقايا H 2 O.
  2. إضافة المياه إلى حل كفيت نظيفة ، ووضع مقياس التألق الطيفي كفيت في.
  3. أداء الإثارة وانبعاث بمسح لتحديد الحدود القصوى لكل (395 نانومتر ~ ~ و 595 نانومتر ، على التوالي).
  4. تنفيذ تفسفر الوقت تسوس التجربة باستخدام المعلمات التالية : الإثارة وانبعاث موجات من تحديد الخطوة 5.3 ، الإثارة وعرض الشق الانبعاثات (5 نانومتر) ، ومضة عدد (100) ، وتأخير الأولي (0.01 مللي ثانية) ، وتأخير الحد الأقصى (13 مللي ثانية) ، وزيادة تأخير (0.1 مللي ثانية). هذه الشروط هي مناسبة لمعظم المجمعات ، ولكن يمكن زيادة الحد الأقصى للتأخير والقيم الزيادة أو النقصان عن الأنواع مع أوقات طويلة للغاية الاضمحلال أو قصيرة للغاية.
  5. كرر الخطوة مع 5.4 الحل D O 2 أعدت في الخطوة 5.1.
  6. من بيانات التلألؤ - تسوس تم الحصول عليها في 5.4 و 5.5 ، مؤامرة سجل الطبيعية كثافة مقابل الوقت. المنحدر من هذه الخطوط هي معدلات تسوس (τ -1) (الشكل 2). في هذا الفيديو ، واستخدام Microsoft Excel 2007 لإنشاء سجل المؤامرات الطبيعي من البيانات الخام. استخدام معدلات تسوس في المعادلة التي وضعتها هوروكس وزملاء العمل (مكافئ 1) 3. إذا كان يحتوي على يغند OH NH أو مجموعات منسقة لهذا المعدن ، ثم يجب أن يتم تعديل هذه المعادلة قبل الاستخدام 3.

مكافئ 1 : figure-protocol-1

6. Relaxivity القياسات

  1. حدد وضع التطبيق المطلوب على الاسترخاء محلل الوقت : T 1 (طولية وقت الاسترخاء) أو تي 2 (عرضية وقت الاسترخاء).
  2. إعداد سلسلة من العينات التي تحتوي على تركيزات مختلفة من الغادولينيوم الثالث المحتوية المعقدة في مذيب مائي. في هذا الفيديو ، واستخدام المياه والمذيبات وحلول 10.0 ، 5.00 ، 2.50 ، 1.25 ، 0.625 ، وأعدت 0 مم. ويمكن استخدام محاليل مائية أخرى أو مخازن ، ولكن من المهم استخدام المذيب كما فارغة. الحجم النهائي للعينة غير محددة في الصك الذي يتم استخدامه.
  3. وضع العينة في الصك واتركه لمدة 5 دقائق لكي تتوازن درجة الحرارة إلى وثيقة (37 درجة مئوية في هذا الفيديو).
  4. تحديد وقت الاسترخاء (في وحدات من ليالي) عن طريق تعديل المعلمات من البرنامج للحصول على منحنى سلس الأسي ل تي تي 1 أو 2 (ممثل عن منحنيات T 1 و T 2 وترد في الشكل 3).
  5. كرر الخطوات من 6.3 و 6.4 لجميع العينات بما في ذلك فارغة.
  6. حساب معكوس T قياس 1 أو 2 في تي القيم وحدات من ليالي -1.
  7. رسم 1 -1 أو تي تي 2 -1 القيم مقابل تركيز الثالث GD (في وحدات ملم). بسبب طبيعة استرطابي المجمعات التي تحتوي على كلمة المدير العام الثالث ، تأكيد تركيز الثالث الغادولينيوم باستخدام القياس الطيفي الذري امتصاص أو بالحث البلازما مطياف الكتلة بالإضافة. تناسب مؤامرة مع خط مستقيم. ويرد مؤامرة ممثل في الشكل 4.
  8. المنحدر من خط تركيبها هو relaxivity (ص ص 1 أو 2 من أجل T 1 و T 2 على التوالي) ، وحدات من ليالي ملي -1 -1.

7. ممثل النتائج

وقد شملت بيانات تمثيلية للخطوات في هذا البروتوكول في جداول وأرقام القسم. بالإضافة إلى عدد المياه والتنسيق وتوصيف relaxivity الموصوفة في هذا البروتوكول ، فإنه من المهم أن تميز المنتجات النهائية باستخدام التقنيات الكيميائية القياسية. ويمكن الحصول على هوية المركب باستخدام مطياف الكتلة ، وممثل أطياف الشامل التي تبين أنماط التشخيص النظير للمؤتمر الثالث الغادولينيوم -- وتظهر اليوروبيوم الثالث التي تحتوي على مجمعات في الشكل 5. علاوة على ذلك ، لعدم GD - III

figure-protocol-2
الشكل 1 مخطط العام لmetalation وتنقية : مخطط تصور عام لإجراء metalation وأسباب اختيار طرق تنقية مختلفة.

figure-protocol-3
الشكل 2 التلألؤ الكثافة المؤامرة : مؤامرة ممثل سجل الطبيعي للكثافة في مقابل الوقت من الباب 5. يتم استخدام المنحدرات من خطوط المولدة من المنحنيات مماثلة حصلت لحلول المياه وD O 2 1 مع مكافئ لتوصيف عدد المياه والتنسيق بين الاتحاد الأوروبي الثالث التي تحتوي على مجمعات.

figure-protocol-4
الشكل 3 منحنيات الاسترخاء الوقت الاضمحلال : بيانات عن الممثل (يسار) تي 1 و (يمين) اقتناء تي 2. ان الانحراف عن هذه الأشكال منحنى إنتاج بيانات يمكن الاعتماد عليها.

figure-protocol-5
الشكل 4 تقرير Relaxivity : مؤامرة ممثل 1 / T 1 مقابل تركيز الثالث GD. المنحدر من خط وتركيبها هو relaxivity وحدات من ليالي ملي -1 -1.

figure-protocol-6
الشكل 5 أطياف القداس : الممثل أطياف الشامل التي تبين أنماط النظائر المشعة لتشخيص (يسار) الغادولينيوم الثالث والتي تحتوي على مجمعات (يمين) الاتحاد الأوروبي الثالث التي تحتوي على مجمعات. الأسود قمم غاوسي تمثل توزيع النظائر النظرية والخطوط الحمراء هي البيانات الفعلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا للعدد المتزايد من المنشورات التي تتضمن عوامل التباين القائم على انثانيد 14/04 ، فمن المهم أن يتم توخي الحذر في إعداد وتنقية ، وتميز المنتجات لضمان تحقيق نتائج استنساخه وقابلة للمقارنة. غالبا ما تعتبر هذه المجمعات تحديا لتنقية وتوصيف النسبية لجزيئات عضوية ، نظرا لطبيعة ممغطس والحساسية في أي من المجموعات الفنية التي يمكن استخدامها لbioconjugation. وقد وصف لنا طرق مشتركة لتجميع وتنقية وتوصيف المجمعات اللانثينيدات. ومع ذلك ، عند اختيار أحد هذه الأساليب من المهم النظر ف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نعترف بامتنان صناديق بدء التشغيل من جامعة واين ستيت (MJA) ، وهي منحة مقدمة من المؤسسة الأمريكية للأبحاث الشيخوخة (SMV) ، والطريق إلى الاستقلال الوظيفي جائزة الانتقالية (R00EB007129) من المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية من المعاهد الوطنية الصحة (MJA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الكواشف والمعدات شركة فهرس العدد
EuCl 3 • 6H 2 O سيغما الدريخ 203254 - 5G
ف SCN - BN - DTPA Macrocyclics B - 305
هيدروكسيد الأمونيوم EMD AX1303 - 3
أطياف / بور بيوتك إستر السيليلوز (CE) غشاء غسيل الكلى -- 500 D MWCO فيشر العلمية 68-671-24
ميليبور IC - LG Millex وحدات تصفية فيشر العلمية SLLG C13 NL
زايلينول البرتقال tetrasodium الملح Aesar ألفا 41379
حامض الخليك Fluka 49199
D 2 O كامبريدج النظائر مختبرات ، وشركة DLM - 4-25
أجهزة تنقية المياه ELGA Purelab الترا
عالية الأداء واللوني السائل قياس الطيف الكتلي شيمادزو يمكننا تعريف - 2010EV
الاسترخاء الوقت محلل بروكر mq60 minispec
الأشعة فوق البنفسجية تجاه معمل فيشر العلمية 20-624-00092
تجميد المجفف فيشر العلمية 10-030-133
الرقم الهيدروجيني متر حنا الآلات مرحبا 221
مقياس التألق الطيفي HORIBA Jobin إيفون Fluoromax - 4
الوزن الجزيئي إصدار 6.46 بواسطة حاسبة مونرو ماثيو ، التحميل 17 أكتوبر 2009 http://ncrr.pnl.gov/software/ الوزن الجزيئي حاسبة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
  2. Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
  3. Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
  4. Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
  5. Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
  6. Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
  7. Major, J. L., Meade, T. J. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
  8. Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
  9. León-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
  10. Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
  11. Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
  12. Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
  13. Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
  14. Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
  15. Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
  16. Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
  17. Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
  18. León-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
  19. Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lanthanide ComplexesMRI Contrast AgentsMetalation ProcedureDialysis PurificationRelaxivity MeasurementsWater Coordination NumberFree Metal DetectionMass Spectrometry CharacterizationLuminescence Decay AnalysisRelaxation Time Analysis

Related Articles