مقالة منهجية

الفلورسنت النانوية لقياس تركيز ايون في النظم البيولوجية

DOI:

10.3791/2896

⸱

يوليو 4, 2011

 ,  , 
1Bioengineering Department, Northeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Northeastern University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم جزيئات الفلورسنت المنتجة في المختبر للتركيز ايون ايون التصوير والتدفقات في النظم البيولوجية مثل خلايا السائل خلال الإشارات وخلالي خلال التوازن الفيزيولوجي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنظيم محكم التوازن الأيوني في جميع أنحاء الجسم أمر ضروري للوقاية من الدول المنهكة مثل الجفاف. 1 وفي المقابل ، يتعين على تدفقات ايون السريع على المستوى الخلوي لبدء العمل في إمكانات الخلايا منفعل. تنظيم الصوديوم 2 يلعب دورا هاما في كل من هذه الحالات ، ولكن لا توجد حاليا طريقة لرصد مستمر مستويات الصوديوم في الجسم الحي 3 و 4 تحقيقات الصوديوم داخل الخلايا لا تعطي نتائج مماثلة لتحقيقات مفصلة الكالسيوم. في محاولة لملء كل من هذه الفراغات ، وضعت nanosensors الفلورسنت التي يمكن رصد تركيزات الصوديوم في المختبر والمجراة. 5،6 هذه المجسات تقوم على التكنولوجيا optode ايون انتقائية ، وتتألف من جزيئات البوليمر التي الملدن الاعتراف الصوديوم محددة هي جزء لا يتجزأ العناصر ، fluorophores الحموضة حساسة ، والمواد المضافة. 7-9 ميكانيكيا ، والاعتراف عنصر الصوديوم مقتطفات الصوديوم في الاستشعار. استخراج 10 هذا يسبب الحموضة fluorophore حساسة للافراج عن أيون الهيدروجين للحفاظ على الحياد في إطار استشعار المسؤول الذي يسبب التغيير في مضان. أجهزة الاستشعار الصوديوم هي انعكاس للانتقائية وأكثر من البوتاسيوم الصوديوم حتى بتركيزات عالية داخل الخلايا. 6 وهي مغلفة ما يقرب من 120 نانومتر في القطر مع والبولي ايثيلين جلايكول لنقل توافق مع الحياة. باستخدام تقنيات microinjection ، يمكن تسليم أجهزة الاستشعار في سيتوبلازم الخلايا حيث ثبت أنها لرصد ديناميات الصوديوم الزمانية والمكانية للضرب myocytes القلب. 11 بالإضافة إلى ذلك ، كما أنها تتبع في الوقت الحقيقي والتغيرات في تركيزات الصوديوم في الجسم الحي عند حقنه 3 تحت الجلد في الفئران وهنا ، يمكننا أن نفسر بالتفصيل وشرح منهجية لافتعال nanosensors الصوديوم الفلورسنت وشرح لفترة وجيزة من التطبيقات البيولوجية مختبرنا يستخدم nanosensors عن : لmicroinjection من أجهزة الاستشعار في الخلايا ، والحقن تحت الجلد من أجهزة الاستشعار في الفئران .

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد optode

قبل اتخاذ optode ، aliquots المكونات هي الحاجة بحيث يمكن قياسها بسهولة وتخزينها.

  1. والصوديوم 50 ملغ Ionophore X (NaIX) قارورة والصوديوم 50 ملغ tetrakis [3،5 مكرر (trifluoromethyl) فينيل] بورات (NaTFPB) وسوف تكون كل ترعرعت في tetrahyrdofuran (THF) ، وإلى aliquoted 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي البوليسترين. في غطاء الدخان الكيميائي ، حل 50 ملغ من NaIX في 1 مل من THF في القارورة الشحن ومزيج لضمان أن تكون صلبة قد حلت تماما. نقل 100 ميكرولتر من هذا الحل في 10 أنابيب الطرد المركزي منفصلة. كرر لNaTFPB. السماح لتتبخر في THF غطاء الدخان الكيميائي بين عشية وضحاها ، والتسمية أنابيب الطرد المركزي ووضعها في ثلاجة درجة 4 للتخزين. وهذا يخلق aliquots 5 ملغ من NaIX الجافة وNaTFPB.
  2. حل ثالثا Chromoionophore (CHIII) في 1 مل من THF ونقل إلى قارورة من الزجاج 3 مل. إضافة آخر 1 مل من القارورة إلى THF الشحن CHIII حل أي CHIII المتبقية وإضافة إلى هذه القارورة الزجاجية 3 مل. سيكون هناك ما مجموعه 2 مل الآن. نقل 1 مل من محلول THF CHIII في هجومين منفصلين على 1.5 مل قنينة زجاجية مع قبعات تفلون المغلفة. تخزين حل CHIII في ثلاجة درجة 4 في التركيز النهائي من 5 ملغ / مل.

وسوف تستخدم هذه aliquots والحلول لجعل المواد optode.

  1. ميكرولتر ماصة 66 مكررا (2 - ethylhexyl) sebacate (DOS) في قارورة زجاجية 1.5 مل مع غطاء مطلي المسمار تفلون -- وهذا هو القارورة optode. DOS هو الحل لزجة لذا يجب توخي الحذر لضمان كمية مناسبة من محلول يتم نقلها إلى القارورة. حجم يتوافق مع 60 ملغ من ~ DOS.
  2. تزن من 30 ملغ من كلوريد عالية الوزن الجزيئي (الفينيل) بولي (PVC) ونقل ذلك إلى قارورة optode.
  3. الآن إضافة عناصر وظيفية لaliquoted القارورة optode لإنشاء optode المطلوب. فإن تركيزات النسبية CHIII ، NaIX وNaTFPB تحديد مدى استجابة جهاز استشعار لالصوديوم. ويمكن تعديل هذه التركيزات لدينا أجهزة الاستشعار التي يستجيب بشكل مثالي لتركيزات داخل الخلايا ، مع دينار من 10 ملم ، أو تجمعات خارج الخلية ، مع دينار كويتي من 150 ملم. بالإضافة إلى ذلك ، سيكون هناك دفعة من المرجح أن تقلب دفعة من المواد الكيميائية من البائع ومعايرة أجهزة الاستشعار من الضروري تحديد ما إذا كانت الإجابة الصحيحة هي التي تحدث لكل دفعة جديدة من المكونات الكيميائية. نحن هنا وصف الأسلوب لإنشاء جهاز استشعار مع تركيزات التي تستخدم عادة لقياس الصوديوم داخل الخلايا.
  4. في غطاء الدخان الكيميائية ، ونقل 100 ميكرولتر من CHIII ملغ / 5 مل في محلول THF إلى القارورة optode.
  5. 5 ملغ من حل NaIX في 300 ميكرولتر من THF ونقل 300 ميكرولتر إلى القارورة optode ، وهذا يرتبط إلى 5 ملغ من NaIX.
  6. بحل قسامة 5 ملغ من NaTFPB في 500 ميكرولتر من THF ونقل 20 ميكرولتر من حل optode القارورة ، وهذا يرتبط إلى 0.1 ملغ من NaTFPB.
  7. إضافة ميكرولتر من 80 إلى THF optode القارورة.
  8. الحل في قارورة تحتوي على 30 ملغ optode من البلاستيك ، و 60 ملغ من DOS و 5 ملغ من NaIX ، 0.2 ملغ من NaTFPB ، و 0.5 ملغ من CHIII في 500 ميكرولتر من THF. وقد حلت هذه الدوامة برفق القارورة حتى كل من PVC. ينبغي أن يكون optode اللون الأحمر. وأضاف المبلغ الإجمالي للTHF إلى 500 قارورة ينبغي ميكرولتر بغض النظر عن نسبة من المكونات المستخدمة.
  9. السماح للTHF المتبقية في NaIX وaliquots NaTFPB لتتبخر بين عشية وضحاها ، وإعادة تسمية الأنبوب مع الكمية الصحيحة من المواد الكيميائية.

2. خلق nanosensors

  1. ماصة 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل 1،2 - Distearoyl - SN - Glycero - 3 - Phosphoethanolamine - N -- [ميثوكسي (Polyethyleneglycol) -550] في الكلوروفورم (الربط بين الدهون) في قارورة زجاجية الدرام 4. السماح للكلوروفورم لتتبخر في غطاء الكيميائية الدخان. ويمكن تسريع هذه العملية عن طريق تجفيف حل مع غاز النيتروجين أو الهواء المنزل.
  2. إضافة 4 مل من محلول مائي من المطلوب إلى قنينة الدهن ، مع الربط. مكان القنينة على مقبس المختبر تحت الحافة sonicating ورفع القنينة حتى غيض حوالي 7 ملم عميقة في الحل ويصوتن في السلطة صوتنة منخفضة لمدة 30 ثانية. هنا نستخدم الرقمية برانسون sonifier لتعيين السعة 15 ٪ مع القرن ونصف بوصة الخطوة غيض القطر. يمكن للمحلول مائي يكون أي حل. على سبيل المثال ، لتحديد مدى استجابة أجهزة الاستشعار التي نستخدمها 10 درجة الحموضة 7.2 ملي HEPES مع قاعدة trizma.
  3. بينما يتم sonicated الحل ، 50 ميكرولتر مزيج من المواد optode مع 50 ميكرولتر من ثنائي كلورو ميثان في أنبوب مل microcentrifuge 0.6. مزيج مع ماصة لضمان خلط حتى.
  4. ضبط التحكم sonifier ليصوتن لمدة 3 دقائق. بدء صوتنة وبينما sonicating إضافة إلى حل خليط optode القارورة بغمر طرف ماصة في الحل والاستغناء عن 100 من ميكرولتر حل سريع في واحد حتى الحقن. وينبغي حل بدوره الزرقاء ، depending على استخدام محلول مائي.
  5. السماح للصوتنة أن يستمر لمدة حوالي 30 ثانية ثم خفض جاك بحيث غيض sonicating حوالي 2 ملم عميقة في الحل. هذا ينبغي أن تبدأ في تهوية الحل والحل لن تصبح مبهمة. هذه الخطوة تساعد على إزالة THF المتبقية وثنائي كلورو ميثان من الحل.
  6. مرة واحدة صوتنة اكتمال سحب ما يصل الى الحل nanosensor حقنة 5 مل. نعلق حقنة 0.2 ميكرون تصفية وصرف حل nanosensor إلى قارورة زجاجية مع غطاء رأس المسمار. وينبغي أن يكون الحل واضح وزرقاء إذا تم استخدام محلول مائي يحتوي على أقل من 10 ملم والصوديوم ودرجة الحموضة أقل من حوالي 9. خلاف ذلك ، ينبغي أن يكون أي لون أو أن تكون وردية اللون.

3. تحديد استجابة nanonsensor

ويستخدم هذا الأسلوب لتحديد مدى استجابة nanosensors المصممة لقياس الصوديوم داخل الخلايا. ينصح تركيزات مختلفة لاستخدامها في تركيز الصوديوم خارج الخلية nanosensors.

  1. جعل الحلول الأسهم من 10 ملي HEPES (0 نا) وكلوريد الصوديوم 1M (كلوريد الصوديوم) في 10 HEPES مم (1 م نا) ، ودرجة الحموضة في كل من هذه الحلول إلى 7.2 باستخدام قاعدة trizma. مزيج من الحلول الأسهم 0 و 1 نا نا م في 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية لإيجاد حلول مع : 0 ، 1 ، 5 ، 10 ، 20 ، 50 ، 100 ، 200 ، 500 ، 1000 تركيزات كلوريد الصوديوم ملم.
  2. استخدام لوحة ضوئية أسفل 96 البئر لتحديد الاستجابة. إضافة 100 ميكرولتر من كل تركيز الصوديوم إلى 3 آبار في عمود. هذا وسوف تنتج مجموعة واسعة من 3 آبار 10 ×.
  3. إضافة إلى كل من 100 ميكرولتر من nanosensors الطازجة وتحميلها الى microplate مقياس التألق. نستخدم أجهزة الجزيئية Spectramax M3.
  4. قراءة كل جيدا مع موجات التالية :
الإثارة (نانومتر) الانبعاثات (نانومتر) قطع (نانومتر)
488 570 530
488 670 610
639 680 665

كثافة nanosensor في كل طول موجي يعتمد على تركيز الصوديوم. استخدام الطول الموجي يعتمد على التطبيقات. لقياسات ديناميات الخلايا بطيئة ، ونحن نستخدم 488 nm/570 نانومتر (الإثارة / الانبعاث) و 488 نانومتر nm/670 التي تسمح لنا بأن نسبة موجات سنتين وخفض الضوضاء.

  1. تقليديا ، يتم تحويل البيانات إلى optode القيم التي هي : α = (I -- I دقيقة) / (I ماكس -- أنا دقيقة) ، حيث I هي الشدة عند تركيز الصوديوم معين ، أنا مين هو أدنى كثافة في القياسات استجابة وانا ماكس هو أعلى كثافة في القياسات الاستجابة. إما بتحويل نسبة كثافة في 570 نانومتر مقسوما على 670 نانومتر في شدة أو كثافة بحوالي 680 نانومتر إلى α.
  2. استخدام برامج التخطيط ، وعادة ما تستخدم إما Excel أو المنشأ في المختبر ، لمؤامرة α مقابل سجل للتركيز الصوديوم ، وإعداد سجل للتركيز الصوديوم صفر -1. تناسب المنحنى السيني للاستجابة. من المنحنى ، وحساب تركيز الصوديوم في α = 0.5 الذي يمثل التركيز على الاستشعار التي يستجيب على النحو الأمثل.
  3. ضبط نسبة CHIII ، NaIX وNaTFPB في optode لإنشاء nanosensors مع الاستجابة المثلى حول تركيز الصوديوم في المصالح.

4. التصوير داخل الخلايا

  1. لقياسات داخل الخلايا ، يتم إجراء nanosensors في الجلوكوز ملغ / 5 مل في الماء وmicroinjected في الخلايا.
  2. تنمو الخلايا أو نقلها إلى وعاء زجاجي أو السفلي وغرفة التصوير مع كوب أسفل ساترة.
  3. احتضان الخلايا في وسائل الإعلام واضحة او حل لTyrode. جبل غرفة التصوير أو طبق على مجهر epifluorescence. نستخدم LSM زايس 7 مبائر المجهر.
  4. سحب الزجاج الشعرية مع مجتذب ماصة. نستخدم سوتر المشتعلة البني مع P - 97 OD 1 ملم ، 0.78 ملم معرف الزجاج ، وقطره حوالي 300-500 الحافة النهائية نانومتر.
  5. الردم ماصة بمحلول nanosensor باستخدام المحاقن والإبر هاملتون ، أو مسطحة microtip وماصة ملف.
  6. تحميل ماصة الى صاحب هذا هو تعلق على micromanipulator وتوصيلها إلى نظام حقن ضغط رقابة. هنا نستخدم بيرلي 6000 PCS EXFO micromanipulator والأنظمة الطبية حاقن الشركة.
  7. انخفاض ماصة على رأس الخلية وإلى السيتوبلازم ، وأحيانا من الضروري "الحنفية" صاحب تتلاعب على اختراق الغشاء. حقن محلول nanosensor والانسحاب بسرعة ماصة.

5. التصوير في فيفو

وقد تم استعراض جميع الإجراءات التي وافقت عليها ورعاية الحيوان في جامعة نورث واللجنة الاستخدام.

  1. Nanosensorsلفي الجسم الحي ، يتم إجراء التصوير خارج الخلية في الفوسفات مخزنة المالحة وتعديلها لديها استجابة المثلى لصوديوم عند تركيز الصوديوم من 135 ملم.
  2. لحقن انشاء والتصوير من nanosensors الفلورسنت في الفئران ، ونحن نستخدم لومينا IVIS الثاني وحدة التخدير المرتبطة بها. تطهير تحريض وغرف التصوير. مكان CD1 الفئران عارية (20G تقريبا) في غرفة الاستقراء ويعرضهم لisoflurane ، وflowrate isoflurane في المئة من الأوكسجين وتدار سوف تختلف تبعا لنوع ووزن الفئران. انتظر الفئران لتصبح تخدير كامل.
  3. بعد تخدير الفئران هي ، إزالة الفئران من غرفة الحث ومكان الى غرفة التصوير. الحفاظ على الفئران تحت التخدير. لكل الماوس ، تطهير المناطق الحقن المطلوب.
  4. المحاقن المعقمة ملء 31G الأنسولين مع 10 ميكرولتر من nanosensors مع التأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء.
  5. باستخدام الملقط ، فهم طية صغيرة من الجلد على طول الجزء الخلفي من الماوس في موقع الحقن المطلوب. بينما يمسك الجلد ، وإدراج حقنة في الجلد مع شطبة مواجهة وموازية إبرة في الجلد.
  6. قبل حقن أجهزة الاستشعار ، وتنسحب على المكبس حقنة لضمان عدم إدخال الإبرة في وعاء دموي. ثم ، حرك بلطف الحق إبر واليسار لإنشاء جيب داخل الجلد. وهذا التقليل من الضغط الخلفي الذي يؤدي إلى تسرب الاستشعار من موقع الحقن. حقن أجهزة الاستشعار وإزالة بلطف الحقنة.
  7. بلطف تطبيق الضغط على موقع الحقن ، ويمحو أي الحل الذي قد تسربت من موقع الحقن. وهذا تقليل مضان من أجهزة الاستشعار التي لا يتم حقنها في الجلد.
  8. تكرر الخطوات من خلال 5.4 5.7 حتى يتم الوصول إلى عدد من المجالات الحقن المطلوب. ينصح حقن ستة مواقع متباعدة بشكل متساو على الجانب الأيمن والأيسر من الخلف. لكل فرد الماوس ، تغيير الإبر إذا الإبرة يصبح من الصعب إدراجها في الجلد. إبر لا ينبغي أن تكون مشتركة بين الفئران ، وهذا سيقلل انتقال المرض أو انتقال التلوث بين الفئران.
  9. للتصوير وأجهزة استشعار الصوديوم الفلورسنت ، ونحن على حد سواء الحصول على brightfield الفلورسنت والصور من الفئران باستخدام مجموعات التصفية الأكثر تطابقا مطابقة nm/680 640 نانومتر (الإثارة / الانبعاث) طيف nanosensors والتي تقلل أيضا تألق ذاتي للجلد.

6. ممثل النتائج

figure-protocol-1
الشكل 1. منحنيات الاستجابة من خمس مجموعات مختلفة لnanosensor الصوديوم. يمثل كل مجموعة من تركيبات nanosensors optode المختلفة التي كان على نفس القدر من CHIII ، NaTFPB ، بولي كلوريد الفينيل ودوس ولكن كميات متفاوتة من NaIX. تم تحويل البيانات إلى القيم α باستخدام كثافات نانومتر 639/680. البيانات بمعدل 3 أشرطة الخطأ ، أغفل عن الوضوح ، مع منحنى السيني المجهزة به المنشأ. في هذا المنحنى ردا على ذلك ، كان أقصى تركيز الصوديوم تستخدم 500 ملم. تراوحت دينار من الصوديوم للnanosensors الصوديوم من 10 ملم (الماس البرتقال) إلى حوالي 150 مم (المربعات السوداء).

figure-protocol-2
الشكل 2. المصبوبة myocytes القلب الولدان. ومثقف الخلايا على ساترة ، التي شنت على المجهر وحقنوا nanosensors الصوديوم. وأظهرت الفلورسنت (639 نانومتر الإثارة) ، brightfield ، وتراكب. علما بأن بعض المجموعات استشعار يحدث ولكن قد مورفولوجيا الخلايا العادية ، وأجهزة الاستشعار وتنتشر في جميع أنحاء العصارة الخلوية وليس هناك أي تحميل النووية.

figure-protocol-3
الحقن تحت الجلد الرقم 3. nanosensors من الفئران مع الصوديوم. وأدلى تسعة حقن مختلفة من nanosensors الصوديوم في الفضاء تحت الجلد من الفئران عارية. كلاهما مضافين مجال مشرق والصور فلوري (640/680).

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وينبغي تشكيل nanosensors اتخاذ أي أطول من 10 دقيقة مرة واحدة أحرز الحل optode وتجفف الدهون PEG. يمكن Optode ليس فقط عندما تكون هناك حاجة بسرعة ، ولكن عند تخزينها في 4 درجات مئوية ، وأنها يمكن أن تكون مستقرة لمدة شهور. أظهرنا أن nansensors ، التي تشكلت مرة واحدة ، هي مستقرة في محلول لمدة أسبوع على الأقل ، إلا أنه يجب توخي الحذر لمنع photobleaching خلال هذا الوقت من خلال منع nanosensors 6 من الضوء وبينما تظاهر nanosensors الصوديوم هنا ، تم optodes خلقت لأيونات بيولوجيا معظم ذات الصلة ، مثل البوتاسيوم وكلوريد. 10،12 لدينا أيضا تمديد هذه التكنولوجيا لجزيئات صغيرة مثل الجلوكوز. 13

بالإضافة إلى توليد nanosensors لرصد analytes مختلفة ، وهذه nanosensors قابلة للتغييرات أخرى من شأنها أن تجعل من المفيد لهم في معظم التجارب البيولوجية. على سبيل المثال ، طلاء السطح ، ويمكن في هذه الحالة بسهولة بولي (جلايكول الإثيلين) ، يمكن تغييرها باستخدام أي جزيء amphiphilic أن ذوبان في الماء. وهذا يتيح إمكانية functionalizing هذه الجسيمات النانوية لتطبيقات مختلفة أو الأهداف. ويمكن أيضا حجم جزيئات أن تعدل عن طريق تغيير طلاء السطح ، وشدة صوتنة أو استخدام المذيبات.

كانت مؤشرات الكالسيوم الفلورسنت لا تقدر بثمن في تحديد الخلايا إشارات الكالسيوم ، ولكن لا الأصباغ الصوديوم الحساسة المتوفرة لديهم نفس الخصائص المثالية. النانوية تهدف إلى توفير Optode طريقة بديلة لأيونات intracellularly التصوير تم في مجال التنمية لسنة 14 ونحن بنينا على هذه الأبحاث السابقة لإنشاء nanosensors محددة للتصوير الصوديوم داخل الخلية والذي نأمل أن توفر وسيلة لفهم الكيفية التي تؤثر إشارات الصوديوم الخلوية وظيفة تعديلات في الإشارة التي تؤدي إلى أمراض معينة.

استخدام nanosensors الفلورسنت في الجسم الحي يوفر الوقت الحقيقي بديل عن الحد الأدنى الغازية analytes الرقابة على وسائل أخرى مثل الدم تلفت ، وقد أظهرت 3 الصوديوم والجلوكوز nanosensors على أساس التكنولوجيا أعلاه لتعقب التغييرات في الصوديوم والجلوكوز ، على التوالي في فيفو. 3،13 ومع ذلك ، توجد حاليا قيود على هذا الأسلوب كأداة للرصد. على سبيل المثال ، يجب أن تحتوي على أجهزة استشعار fluorophore مع طائفة تحول نحو كاف الحمراء الأشعة تحت الحمراء بالقرب من أجل تقليل تألق ذاتي خلفية من الجلد 15 ثانيا ، تقنية الحقن الحالية لا تنتج حقن الموحد للnanosensors التي قد تنجم عن مثل هذه أخطاء والاختلاف في عمق الحقن. على الرغم من هذه القيود ، ويمكن تطوير هذه nanosensors الفلورسنت ومظاهرتهم ناجحة جعل هذه المجسات أداة بحث لا تقدر بثمن وطريقة لرصد صحة المريض.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتمول وJMD MKB من خلال العلوم لطب النانوي IGERT وبرنامج التكنولوجيا في جامعة نورث إيسترن (بتمويل من لجنة التحقيق الوطنية وجبهة الخلاص الوطني منحة DGE - 0504331). كما تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني الطبي العام R01 المنح العلوم GM084366. ونحن نشكر أيضا Saumya داس وانطوني روزنزويج من BIDMC في بوسطن لتوفير myocytes القلب والنقدي كيفن لمساهمته في تطوير بروتوكول الحيوان.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم المنتج شركة رقم كتالوج تعليقات
IVIS الصك الثاني لومينا حزمة الفرجار العلوم الحياتية 126273
CD - 1 الفئران عارية نهر تشارلز قانون سلالة : 086 العوز المناعي
محاقن الأنسولين دينار بحريني 328438 10/03 سم مل ، 8mm و 31G
الوزن الجزيئي عالية PVC سيغما
DOS سيغما
CHIII سيغما
NaTFPB سيغما
NaIX سيغما
رقيقة الجدران الزجاجية الشعرية سوتر
PEG الدهون أفانتي الدهون القطبية

الجدول 1. يوفر قائمة من المواد الكيميائية والمعدات المستخدمة في هذا الإجراء. وقد تم شراء جميع المواد الكيميائية غير المدرجة مشتركة من سيغما.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hyponatremia. N Engl J Med. 342, 1581-1589 (2000).">Adrogue, H. J., Madias, N. E. Hyponatremia. N Engl J Med. 342, 1581-1589 (2000).
  2. BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity. Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).">Kim, D. Y. BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity. Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).
  3. in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors. Integr Biol (Camb). , (2010).">Dubach, J. M., Lim, E., Zhang, N., Francis, K. P., Clark, H. in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors. Integr Biol (Camb). , (2010).
  4. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).">Minta, A., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).
  5. Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots. Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).">Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots. Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).
  6. Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size. Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).">Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size. Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).
  7. A sodium-selective optrode. Mikrochim Acta III. III, 109-109 (1989).">Schaffar, B., Wolfbeis, O. A sodium-selective optrode. Mikrochim Acta III. III, 109-109 (1989).
  8. Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma. Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).">Seiler, K. Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma. Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).
  9. Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence. Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).">Zhujun, Z., Mullin, J., Seitz, W. Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence. Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).
  10. Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics. Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).">Bakker, E., Buhlmann, P., Pretsch, E. Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics. Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).
  11. Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).">Dubach, J. M., Das, S., Rosenzweig, A., Clark, H. A. Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).
  12. Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells. Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).">Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells. Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).
  13. Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied, , Forthcoming.
  14. Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells. Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).">Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells. Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).
  15. in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging. Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).">Frangioni, J. V. in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging. Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة