إعداد الكبار ذبابة الفاكهة لعيون Sectioning رقيقة والتحليل المجهري

ملخص

نهج موحد لإعداد الكبار ذبابة الفاكهة عيون لشبه رقيقة sectioning والتحليل المجهري الضوء هنا. ويمكن استخدام بروتوكول للتحليل الصرفي من العيوب الجسيمة العين ، أو يمكن استخدامها مع التعديلات وأشار إلى تحديد الاحتياجات من الجينات الوراثية في أنواع معينة من الخلايا في العين (تحليل نسيلي مبصرات مثلا) أو لأغراض التحليل المجهري الإلكترون.

الملخص

منذ فترة طويلة ذبابة الفاكهة تستخدم نظام نموذجي لدراسة التنمية ، ويرجع ذلك أساسا إلى السهولة التي كان لين العريكة وراثيا. على مر السنين ، وقد وضعت مجموعة كبيرة من سلالات متحولة والحيل التقنية للسماح أسئلة معقدة والإجابة عليها في كمية معقولة من الزمن. لقد تم الحصول على الرؤية الاساسية في تفاعل مكونات جميع الممرات الرئيسية المعروفة في إشارة إلى الأمام وعكس الدراسات الجينية ذبابة الفاكهة. وقد ثبت للعين أن يطير جيدا بشكل استثنائي مناسبة لتحليل طفرية ، منذ ذلك الحين ، تحت ظروف المختبر ، والذباب يمكن أن يعيش من دون عيون وظيفية. وعلاوة على ذلك ، يتألف سطح العين الحشرات من بعض العيون 800 وحدة الفرد (أو جوانب ommatidia) الذي شكل منتظم ، وسطح أملس عندما نظرت إلى تشريح تحت المجهر. وهكذا ، فإنه من السهل أن نرى ما إذا كان قد تحور تؤثر على التنمية العين أو النمو من خلال النظر خارجيا لفقدان سطح أملس ('العين الخام" النمط الظاهري ؛ الشكل 1) أو الحجم الكلي العين ، على التوالي (للاطلاع على أمثلة من الشاشات على أساس مورفولوجيا العين الخارجية انظر على سبيل المثال ^1). تحليلات مفصلة لاحقة من الظواهر تتطلب تثبيت العين ، تضمين البلاستيك ورقيقة sectioning عيون الكبار.

عين ذبابة الفاكهة يطور من القرص العين يسمى تخيلي ، كيس من الخلايا الظهارية التي تتكاثر والتفريق خلال مراحل اليرقات والعذراء (انظر ² للمراجعة مثلا). كل ommatidium يتكون من 20 زنزانة ، بينهم ثمانية من المستقبلات الضوئية (PR أو R الخلايا ؛ الشكل رقم 2) ، وأربع خلايا مخروطية عدسة إفراز ، الخلايا الصبغية ('السداسي" حول الخلية R - الكتلة) وشعيرات ملف. ومبصرات كل ommatidium ، ومعظم التعرف عليها بسهولة من قبل هذه العضيات الحساسة للضوء ، rhabdomeres ، هي التي نظمت في شبه المنحرف تتكون من "الخارجي" ستة (R1 - 6) واثنين من "الداخلية" المستقبلات الضوئية (R7 / 8 ؛ R8 [التين 2] هو تحت R7 ، وبالتالي ينظر فقط في الفروع من المناطق العميقة من العين). يتم محاذاة بدقة شبه منحرف من كل جانب مع تلك جيرانها والمحاور الشاملة وظهري بطني الأمامي الخلفي من العين (الشكل 3A). على وجه الخصوص ، من ommatidia (الأسهم السوداء والحمراء ، على التوالي) وظهري بطني نصفين من العين هي صور طبق الأصل من بعضها البعض ، وتتوافق مع شكلين مراوان مستو وضعت خلال إشارات الخلية القطبية (انظر على سبيل المثال للمراجعة ^3).

وصف طريقة لتوليد أقسام العين شبه رقيقة (مثل تلك التي قدمت في الشكل 3) هنا هو تعديل طفيف من وصفها توملينسون في الأصل من قبل وجاهز ^4. فهو يسمح للتحليل الصرفي لجميع الخلايا باستثناء الخلايا المخروطية شفافة. بالإضافة ، يمكن استخدام صبغة R - الخلايا (السهام الزرقاء في الشكل 2 و 3) كعلامة خلية مستقلة عن التركيب الوراثي للخلية - R ، ومتطلبات الوراثية وبالتالي من الجينات في مجموعة فرعية من الخلايا يمكن R بسهولة يمكن تحديد ^5،6.

البروتوكول

1. يطير تشريح الرأس

1. تأكد من حصولك على جميع المواد في متناول اليد (بما في ذلك الشرائح المغلفة الجيلاتين). إعداد غلوتارالدهيد ومثبتات الأزميوم (أنظر أدناه). في النمط الوراثي لتضمين ، قسامة الإصلاح غلوتارالدهيد 200μl حل في 1.5 مل من الأنابيب على الجليد.
2. تخدير الذباب على منصة CO ₂ (ونحن تشريح عادة رؤساء الطيران سبعة إلى تضمين ستة في التركيب الوراثي في حال دمرت رئيس واحد خلال الداخلي).
3. عقد واضغط قليلا من القفص الصدري على الجانب ، ويطير حتى الظهرية ، مع ملاقط واستخدام مشرط حاد لقطع رأسه.
4. استقرار الرأس تطير من خلال لمس الرقبة مع شريحة وملاقط بعناية قبالة جزء صغير من عين واحدة. يعزز هذا الاختراق لتثبيتي (إذا كنت تنوي استخدام مقاطع عينيك نسيلي للتحليل ، وخفض العين مع الحيوانات المستنسخة لا أو أصغر). تجنب لمس العين وإلحاق أضرار سليمة أنه سيتم في وقت لاحق مقطوع.
5. وينبغي أن تلمس الرأس مع ملاقط أو مشرط وعلى سطح العين وقطع رأسه نقل إلى غلوتارالدهيد / الفوسفات مثبت على الجليد (الرؤساء غالبا ما تطفو على السطح من تثبيتي) لم رؤساء تشريح أن يوضع في الإصلاح غلوتارالدهيد لفترة أطول من 15 دقيقة قبل إضافة الأزميوم. كرر الخطوات من 1،2-1،5 مع الذباب أخرى من نفس النمط الجيني.

2. التثبيت وتضمينها (استخدام قفازات لجميع الخطوات!)

1. تدور flyheads في أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة إيبندورف في 10000 دورة في الدقيقة. تستمر حتى لو لم يكن لرؤساء المصارف.
2. إضافة 200μl الحل ₄ أوسو وإصلاح ما لا يقل عن 30 دقيقة وتصل إلى 1 ساعة على الجليد.
3. باستخدام ماصة باستور ، وإزالة الحل غلوتارالدهيد / الأزميوم (تأكد من حسن استخدام إجراءات التخلص من النفايات!) واستبداله بمحلول الأزميوم 200μl. على الجليد لاحتضان 1-6 ساعات. تأكد دائما مغطاة تماما مع رؤساء وسائل أبدا إزالة جميع من الحل ورؤساء أو العينين قد تنهار!
4. باستخدام ماصة باستور ، تجاهل تثبيتي ، إضافة الإيثانول 0.5 1ml 30 ٪ واحتضان ما لا يقل عن 5 دقائق على الجليد (تأكد من حسن استخدام إجراءات التخلص من النفايات منذ الآن يحتوي على الايثانول الأزميوم!).
5. كرر الخطوة أعلاه مع 50 ٪ ، 70 ٪ ، (80 ٪) و 90 ٪ و 100 ٪ من الإيثانول مرتين. وتشمل الخطوة الايثانول 80 ٪ في حالة استخدام العينين عن التحليل المجهري الإلكترون. بعد الخطوة تغسل 70 ٪ ، ويمكن إزالة عينات من الجليد.
6. محل الايثانول مع حجم مساو من أكسيد البروبيلين (متقلبة ، تواصل العمل في هود). احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
7. تكرار غسل أكسيد البروبيلين. العمل على دفعات إذا تجهيز العديد من المورثات في الوقت ذاته لتجنب انهيار في العينين نتيجة للتبخر من أكسيد البروبيلين.
8. إزالة أكثر من أكسيد البروبيلين واستخدام ماصة نقل البلاستيكية ، إضافة لحوالي 500μl 01:01 الراتنج : حل أكسيد البروبيلين. يوازن بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.

3. التضمين والترتيب في قوالب

1. تأكد من أن يتم تسمية جميع القوالب لتتبع المورثات الخاص مختلفة ، ثم ملء قوالب مع الراتنج 100 ٪. لا يفيض (لا "التلال العالية" على سطح القوالب عندما تبحث مباشرة عبر سطح العفن). استخدام الراتنج الثابت للتحليل EM.
2. باستخدام ماصة نقل وإزالة الراتنج 50 ٪ من الرؤساء ، مع استبدال الراتنج 100 ٪ ، واحتضان ل3-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. حيث تسللت مع رؤساء الراتنج ، وأنها سوف تغرق إلى قاع الأنبوب.
3. استخدام المسواك الذي تضرر على سطح صلب مرة واحدة لإنشاء ربط قليلا ، ونقل رئيس واحد في ذلك الوقت في قالب.
4. مكان رقائق الألومنيوم في منطقة العمل من النطاق الخاص بك تشريح لحمايته من تسرب الراتنج.
5. باستخدام إبرة تشريح وعلى الرغم من دوامة يبحث الخاص ونطاقها في الرأس قليلا في الراتنج وتحرك بحذر الى الجزء السفلي من العفن على مقربة من نهاية مدببة.
6. محاذاة بعناية سطح العين (!) سليمة (أو مستقبلك الطائرة sectioning إذا كنت تريد أن يكون المقاطع العرضية) الرقبة إلى أسفل مع الجدار الأمامي من العفن ، والتأكد من الحفاظ على سطح عرضية من العين ما يقرب من نصف الرأس قطر بعيدا عن الجدار العفن. في حالات نادرة ، وهو ينهار العين التي يمكن أن ينظر إليه باعتباره مساحة فارغة بين سطح العين وبشرة الرأس. إذا كان لديك العين انهار استبداله العين الغيار ^ال 7.
7. نكرر مع جميع رؤساء. فعلت مرة واحدة مع جميع التحالفات ، وإعادة فحص كل العيون للتأكد من أنهم لم يتحرك عند إزالة الإبرة من الراتنج.
8. إذا كان لديك مشاكل مع تحريك العينين عند إزالة الإبرة تشريح ، والموقف عينه على النحو المرغوب فيه ، سرعان ما تتراجع الإبرة بعيدا قليلا عن الرأس وببطء ثم إزالة الإبرة تماما.
9. خبز القوالب بين عشية وضحاها في 70 درجة مئوية.

4. التشذيب وsectioning

1. إزالة الكتل الصلبة من قوالب قوالب عن طريق الانحناء ، كeeping المسار الذي يقابل كتلة التي الوراثي (مثل تخزين في قوارير صغيرة التلألؤ).
2. لالتشذيب ، واستخدام تشوك المناسبة لمشراح الخاص الذي شنت على مواجهة كتلة من زجاجي أو الألومنيوم. كتلة جبل لتقليم ، العين يصل ، في ظرف.
3. ضمن نطاق تشريح الحلاقة باستخدام تفلون المغلفة زايد ، وقطع بعناية قبالة فقط الطبقة العليا من حظرك. هذا وسوف يغادر سطح واضحة على الرغم من الذي يجب أن تشاهد بالعين وبالتالي لا يمكن أن يتنبأ بمستقبل الطائرة sectioning. تجنب قطع أصابعك!
4. قطع البلاستيك الزائد على جانبي الرأس وعلى الجبهة (أي ما كان ليكون الجزء العلوي من القالب عند محاذاة العينين) حتى يتم قطع معظم من البلاستيك حول رأسه قبالة. فمن الأفضل لنهج ببطء الرأس بقطع عدة طبقات رقيقة من البلاستيك.
5. باستخدام شفرة حلاقة نظيفة ، وإزالة بعناية طبقات رقيقة من أعلى العين في الطائرة التي تريدها بالضبط لاحقا (عادة بشكل طفيف للعين ، في زاوية طفيف إلى السطح القالب الأصلي).
6. تستمر حتى مجرد بداية لخفض بعيدا السطح الخارجي للعين. تأكد من استخدام المناطق النظيفة من الحصول على شفرة لامعة ، والسطح الشفاف ، مما يجعل من الأسهل في محاذاة مشراح.
7. لانقاذ على شفرات الحلاقة ، واستخدام شفرات لكبار السن وتقليم الخام حول جوانب كتلة واستخدام شفرة جديدة لتقليم الدقيقة (أول خطوة من نوعها و 4.6). في النهاية سيكون لديك هرم three الوجهين مع كبار مائلا قليلا الوقف ، الذي يتوافق مع الطائرة فرعكم في المستقبل.
8. جبل كتلة في مشراح. سوف sectioning الفعلية تختلف تبعا لنوع مشراح ولن يمكن وصفها بالتفصيل هنا. نستخدم Sorvall MT5000 مع الماس histo سكين الجودة لخفض 0.5 إلى 1μm المقاطع. لتحليل الضوء المجهرية ، هناك اختلافات طفيفة في سمك الباب لا يهم. إذا استنساخ sectioning تميزت القسم الابيض + التحوير ، 1μm المقاطع لضمان الحصول على ما يكفي من حبيبات الصباغ المتاخمة للrhabdomeres في المقطع (الشكل 2).
9. وسوف تطفو على سطح الماء المقاطع. الرافعة الأولى 20-30 مع نهاية المقاطع بالارض من طرف - Q خشبية من تحت سطح الماء في الحركة الدورية ونقلها الى قطرة ماء على شريحة زجاجية مغلفة الجيلاتين (حافظ على لوحة التدفئة بنحو 100 درجة مئوية ).
10. كرر مع أقسام أخرى 20-30. انتظر حتى تبخرت المياه والمقاطع العصا إلى الشريحة. عادة ، من 3 أقسام العيون مرتبة في ثلاثة أعمدة (ثلاث عيون) حسب الصفوف twp (أعلى / أسفل الأبواب) تناسب بشكل جيد على شريحة واحدة.

5. تلوين والتحليل المجهري

1. إلا sectioning الحيوانات المستنسخة والمقاطع وصمة عار. الشريحة مكان مع الأقسام في كتلة التدفئة وضعت في 90 درجة مئوية. الاستغناء طولويدين الزرقاء حل تلطيخ من الحقنة 30 مل موصولة إلى تصفية 0.22μm على الشريحة وصمة عار لمدة 10 ثانية. شطف فورا على نطاق واسع مع الماء المقطر. الهواء الجاف.
2. باستخدام ماصة بلاستيكية نقل وتوزيع 3 قطرات من DPX متزايدة على الشريحة المتوسطة ، وتغطي مع ساترة. برصيد 3 الدايمات والسماح للتصاعد التشدد المتوسطة (مثلا بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة).
3. صورة مع ضوء المجهر. استخدام عدسة 5X 10X أو للعثور على القسم الجيد والتبديل ثم إلى عدسة النفط الغمر 63x لتحليل مفصل والتصوير. نحن عادة استخدام إعدادات التباين المرحلة ، ولكن الساحة المظلمة البصريات العمل كذلك.

6. ممثل النتائج :

في أغلب الأحيان ، هي جزء لا يتجزأ من البلاستيك للنظر في تحليل مفصل من الظواهر الخارجية الكشف عن العين الخام كجزء من الشاشة وراثية أو في عملية اختبار التفاعلات الجينية مع الجينات المعروفة بتأثيرها على هيكل إما عامة أو قطبية العين. وأظهرت نتائج نموذجية من أقسام العيون في الشكل 3. من النوع البري ommatidia (الشكل 3A) تظهر تكمل مبصرة الكامل محاطة شعرية من الخلايا الصبغية. في المقابل ، في الحول (stbm ، الملقب فان جوخ - ⁷⁾ متحولة ، يتم فقدان ommatidial الاقطاب ، وعلى الرغم من أن تكمل مبصرة الكامل هو الحاضر ، وتناوب شرليتي والعشوائية (الشكل 3B). علاوة على ذلك ، منذ أليل stbm مقطوع كان فصيل عبد الواحد ^-- الخلفية ، وحبيبات الصباغ مفقودة في الشكل. 3B. ويبين الشكل 3C مثالا على تحليل نسيلي. مطلوب ذبابة الفاكهة كيناز رو (drok) للتناوب ommatidial فضلا عن السلامة الهيكلية للعين ^8. ويمكن تحديد متماثل drok ² استنساخ بسبب غياب الصباغ في الخلايا الصبغية وrhabdomeres (عادة ، وبفعل الحيوانات المستنسخة باستخدام بلا عيون ، وFLP ف العنصر مع الجين علامة بيضاء وأعرب بقوة تكملة ث الخلفية ^-- طفرة في البرية والأنسجة من نوع متخالف). وبالتالي فمن الممكن تحديد المناطق التي متحولة افتقارها للصباغ. بسبب الحكم الذاتي خلية من تصبغ في R - CELLS المذكورة سابقا ، يمكن تحديد المورثات الفردية R - الخلايا (انظر الشكل في النصال. 3C).

الشكل 1. العين ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجا ممتازا لعلماء الأحياء منذ ذلك الحين ، على النقيض من سطح أملس من العين البرية من نوع (A) ، وسطح العين هي متحولة خارجيا الخام المتداولة (B) ، مما يدل على الظواهر الكامنة وراء العين . في جميع الأرقام ، الأمامي وإلى اليسار والظهرية متروك. الصور تقدمة من الدكتور جنيفر كيرتس ، NMSU ، لاس كروسيس ، شمال البحر الأبيض المتوسط ​​، الولايات المتحدة الأمريكية.

الشكل 2. الصور المجهرية ضوء ommatidia مقطوع واحد باستخدام طريقة وصفها. سبعة فقط R - خلايا مرئية في الوقت الواحد ommatidium ، منذ R7 تقع على رأس R8. (أ ، أ ") وعلى المستوى R7 ، يتم الكشف عن خلية من خلايا الجسم R7 بين R1 و R6 (السهم الأصفر في A'). في المقابل ، على الصعيد R8 (B) ، تم الكشف عن خلية من خلايا الجسم R8 بين R1 و R2 (السهم الأصفر في B '). السهام الزرقاء بمناسبة حبيبات الصباغ الذي يمكن استخدامه كعلامة الصباغ خلية مستقلة.

الشكل 3. تماسي من خلال المقاطع البرية من نوع (A) ، stbm (B) وdrok (C) متحولة عيون ذبابة الفاكهة الكبار. الخطط أدناه المقاطع تدل على قطبية ommatidia (انظر (A) لسهام). تمثل الدوائر ommatidia بعيوب في تكملة مبصرة. الخطوط الصفراء تمثل الخط الظهري / بطني التناظر (خط الاستواء). على النقيض من ommatidia جيدا المنحى من نوع البرية (A) ، يتم فقدان التنظيم في مستو متحولة stbm (B). علما بأن الجزء من متحولة stbm أظهرت تفتقر الصباغ بسبب ث لها ^-- خلفية متحولة. (C) بسبب الطفرات drok مميتة ، لديهم ليتم تحليلها في الحيوانات المستنسخة. وبالتالي ، فإن خلايا الصباغية هي من النوع البري أو متخالف (السهام الزرقاء تملأ) ، في حين R - تفتقر الخلايا الصبغية (السهام الزرقاء فتح) هي متحولة متماثل. بالإضافة إلى عيوب التناوب ، والمسوخ drok كما تظهر العيوب الهيكلية بما في ذلك الأعداد الناقصة أو الزائدة من R - الخلايا. علما بأن للتحليل نسيلي ، المقاطع ليست ملطخة لتجنب حجب حبيبات الصباغ.

المناقشة

ذبابة الفاكهة واستخدام نموذج حي ، وشاشات وراثية أدت إلى تحديد العديد من الأعضاء المؤسسين للعائلات الجينات الأساسية لمعظم المسارات المحفوظة للغاية مما يشير الى ارتفاع حقيقيات النواة بما فيها البشر. منذ ذلك الحين ، تحت ظروف المختبر ، والعين هي وظيفية يمكن الاستغناء عنها من أجل البقاء ، والعين هي الأنسجة وخاصة مناسبة تماما لاكتشاف وظائف الجينات رواية وتقييم الشبكات الجينية. تحليل التركيبية للعين الذبابة باستخدام الطريقة الموصوفة وبالتالي أدى إلى اكتشافات الأساسية ذات الصلة من أجل التنمية والمرض. في البداية ، تم إجراء تحليل وحيد الخلية نسيلي باستخدام الأشعة السينية التي يسببها استنساخ جنبا إلى جنب مع علامات الخلية يعرف الحكم الذاتي مرتبطة ارتباطا وثيقا المتنحية. في الآونة الأخيرة ، وقد سهلت توافر نظام FLP / FRT لتوليد الحيوانات المستنسخة كثيرا من التحليل المظهرية للطفرات المميتة في أقسام العيون ^6،9.

ولا يقتصر تحليل المقاطع إلى مقاطع عرضية العين الموصوفة هنا. إذا رغبت في ذلك ، يمكن محاذاة الرؤوس في أي اتجاه في قوالب ويمكن الحصول على المقاطع العرضية لدراسة الطبقات الأعمق في رأسه مثل الصفيحة والنخاع. بروتوكول الموصوفة هنا هو بالتالي وسيلة لتحليل تنوعا من البالغين العين ورأس ذبابة الفاكهة الهياكل.

المواد

معدات عامة :

• لتربية ذبابة عامة انظر ¹⁰
• مجهر تشريح القياسية (مثل نيكون ستيريو تكبير المجهر SMZ - 645) ، ويفضل مع عصابة مصدر للضوء لمنع يلقي ظلالا من يديك.
• CO ₂ وسادة يطير ، مع تغطية ورقة Whatman 3mm ل توفير حماية ضد الأوساخ أثناء تشريح.
• الشرائح المغلفة الجيلاتين : الجيلاتين ويذوب 10G 1G CrKSO _{4 ×} 12 H ₂ O في المياه 1L على طبق من ذهب للتدفئة (تقريبا جلب ليغلي ، ويأخذ ما يقرب من 2 ساعة). تراجع الشرائح غسلها جيدا (الصابون) وتشطف (DH ₂ O) في حملة الى حل الجيلاتين والهواء الجاف المغطاة برقائق بين عشية وضحاها.
• فرن التسخين (70 درجة مئوية ، ومناسبة تماما فراغ الأفران القديمة التي كانت تستخدم لتجفيف مرشح النيتروسليلوز لهذا الغرض).
• مشراح قادرة على sectioning سامسونج (0.5-1 أبواب سميكة ميكرومتر) ، مثل تلك المستخدمة من قبل مرافق المجهر الإلكتروني. نستخدم MT5000 Sorvall مشراح مستدق مع الماس Histo سكين الجودة. السكاكين والزجاج العمل أيضا.

تثبيت الحلول :

• يعد حل الأسهم من 0.2 م العازلة الفوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.2.
• إعداد غلوتارالدهيد الصوديوم 2 ٪ في 0.1M العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.2 (يمكن تخزينها في 4 أسابيع 4 درجات مئوية ل). جعل الأقل بما يكفي ليكون في التركيب الوراثي 200μl تريد تضمين. تبقي على الجليد.
• الأوزميوم الحل : 2 ٪ ₄ في أوسو الصوديوم 0.1M العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.2. تقديم ما يكفي فقط أن يكون في التركيب الوراثي 200μl تريد تضمين ، لأن لا يمكن أن يكون الحل المخزنة. تبقي على الجليد.

غلوتارالدهيد وأوسو ₄ سامة للغاية وينبغي التعامل معها بعناية فائقة في غطاء جيد التهوية. نصائح استخدام التصفية عند التعامل مع أوسو ₄ لمنع اسوداد من ماصة الخاص.

الجفاف : جعل 30 ٪ ، 50 ٪ ، 70 ٪ ، (80 ٪) ، 90 ٪ ، والحلول الإيثانول بنسبة 100 ٪. بارد ويفضل 30 ٪ و 50 ٪ و 70 ٪ من الإيثانول على الجليد قبل الاستخدام.

تلطيخ الحل :

1 ٪ طولويدين الأزرق في البوراكس 1 ٪.

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
	ناعم	الثابت
والراتنج	54G	50G
تصليب B	44.5g	50G
مسرع C	2.5G	1.75g
الملدنات D	10G	0.75g

الجدول 1. الراتنج إعداد

لإعداد الراتنج ، وبعناية ، ولكن خلط جميع المكونات جيدا في كوب من البلاستيك باستخدام مغناطيسي مع بقضيب كبير. تجنب الفقاعات. بعد قسامة ، والخلط في قوارير أو حاويات قياسية التلألؤ وتجميد مماثل على -20 درجة مئوية. استخدام الراتنج ميسرة لجميع الطلبات ما لم يكن لديك EM مرفق يسألك عن صعوبة الصياغة. استخدام قفازات للتعامل مع الراتنج (مادة مسرطنة في شكله unpolymerized). لتتبلمر راتنج على المعدات والنفايات ، ويخبز في 70 درجة مئوية خلال الليل. ثم قد يكون التخلص منها بأمان من النفايات والمعدات تنظيفها وإعادة استخدامها. ويمكن تنظيف تسرب راتنج unpolymerized مع الأيزوبروبانول.

الكاشف	المزود	فهرس العدد
يطير سادة	على سبيل المثال جينيسي	59-119
غلوتارالدهيد	سيغما	G7526 - 10 X 10 ML
4 OSO	Polysciences ، وشركة	0972A - 20
Propyleneoxide	الصياد	04332-1
مشرط المقابض ، ل# 3	الصياد	22080046
شفرات المشرط # 11	الصياد	08-916 - 5B
نقل ماصات	الصياد	13-711 - 7M
Durcupan (R) ACM الراتنج	سيغما (Fluka)	44610 - 1EA
إبرة تشريح الصلب	الصياد	S17346
BEEM العفن تضمين المسطحة	الإلكترون المجهري الكيمياء.	70904-12
شفرات الحلاقة المطلية تفلون	الإلكترون المجهري الكيمياء.	71970
Q - غيض (مسحات معقمة)	الصياد	14-959-81
الشرائح الزجاجية	الصياد	12-550-143
تغطية زلات رقم (1) ، 22X60 مم	الصياد	12 - 531K
الجيلاتين	الصياد	ICN96010280
الكروم (III) SO 4 K dodecahydrate	سيغما	243361
الماس Histo سكين ، 6mm	Diatome الولايات المتحدة	صاحب 60
طولويدين يا الأزرق	الصياد	BP107 - 10
البوراكس (بورات ثنائي نا)	الصياد	AC20629 - 1000
DPX تصاعد المتوسطة	سيغما	44581 - 100ML

الجدول 2. المواد