علاج ثنائي هيدروتستوسترون تحت الجلد (DHT): نموذج الفأر لمتلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS)

الملخص

المصدر: Xue ، P. ، et al. نموذج فأر مفرط الأندروجيني لدراسة متلازمة المبيض المتعدد الكيسات. J. Vis. Exp. (2018).

< ص فئة = "jove_content">توضح هذه المقالة طريقة لإعداد وإدراج ثنائي هيدروتستوسترون (DHT) الكريات لنمذجة متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS) في الفئران. يوضح بروتوكول المثال الإجراء في الفئران المستخدمة في الدراسات الإنجابية والتمثيل الغذائي.   

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. إنشاء نموذج ماوس يشبه متلازمة تكيس المبايض

< p class = "jove_content" >ملاحظة: كانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة ذات خلفية مختلطة (C57 / B6 ، CD1 ، 129Sv) وتم الحفاظ عليها مع الطعام والماء في دورة ضوء / ظلام 14/10 ساعة عند 24 درجة مئوية.

1. تحضير بيليه DHT
   1. أنابيب أحراق الأوتوكلاف للتعقيم. قطع الأنابيب السيلاطية بطول 15 مم بشفرة حلاقة.
   2. أغلق جانبا واحدا عن طريق حقن سيليكون لاصق طبي في الأنبوب بإبرة ناعمة 20 جم متصلة بحقنة سعة 3 مل. يجب سحب المكبس من المحقنة ثم إدخالها في الخزان. يتم إعادة إدخال المكبس ودفعه لأسفل حتى يبدأ في الخروج من الإبرة. تصنع الإبرة الخافتة عن طريق قطع جانب الطرف الحاد لإبرة 20 جم بأي مقص قوي. يجب أن يكون طول السيليكون في الأنبوب أكثر من 2 مم للسماح بتشذيب ما بعد الإنتاج.
   3. يجف طوال الليل ؛ تحقق من وجود فقاعات هواء على الجانب المغلق. وتستخدم تلك التي لا تحتوي على فقاعات هواء لكريات DHT. يمكن استخدام البعض الآخر لكريات التحكم بدون DHT.
   4. ارتد القفازات والقناع والنظارات الواقية ومعطف المختبر قبل صنع DHT-pellet في غطاء لتجنب التعرض للجلد.
   5. صب مسحوق DHT في قارب وزن بلاستيكي واضغط على الجانب المفتوح من الأنابيب اللاصقة المغطاة (المنتجة في 1.1.1) في مسحوق DHT.
   6. يمكن دك مسحوق DHT بمشبك ورق كبير يتم تقويمه. استمر حتى يصل ارتفاع DHT إلى 4 مم (أو الطول المطلوب). تحقق من طول DHT باستخدام المسطرة ، وأغلق الجانب المفتوح بالسيليكون ، وجففه طوال الليل.
   7. قص كل جانب مغلق لجعل طول السيليكون بطول 2 مم. سيكون الطول الإجمالي للحبيبات 8 مم.
   8. ختم جانبي الأنابيب السيلاستية الفارغة كتحكم (بدون DHT) بيليه.
   9. احتفظ بالكريات في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ملفوف بورق الألمنيوم (لمنع التعرض للضوء) في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. تحافظ كريات DHT على فعاليتها الكاملة لمدة 3 أشهر على الأقل من التخزين.
2. إدخال واستبدال DHT
   1. ما يصل إلى 20 يتم غمر كريات DHT أو كريات التحكم بشكل منفصل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 30 مل محلول ملحي معقم 0.9٪ لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية لتحقيق التوازن قبل الإدخال مباشرة.
   2. قبل الجراحة ، يتم تطهير الأسطح والقفازات باستخدام clidox ويتم تغطية أسطح العمل بورق ماص نظيف مدعوم بالبلاستيك (وسادة جراحية). يتم تطهير جميع الأدوات التي تتلامس مع قبل دخول منشأة عن طريق التعقيم. سيتم السماح للأدوات بالجفاف والتبريد قبل الاستخدام.
   3. يتم استخدام إناث الفئران البالغة من العمر شهرين (4-5 فئران / قفص). يتم حقن الفئران داخل الصفاق مع زيلازين (3.5 مجم / كجم وزن الجسم) والكيتامين (78.8 مجم / كجم وزن الجسم) باستخدام حقنة الأنسولين. حسابات خلط وجرعات التخدير موجودة في الجدول 1.
   4. بعد تحقيق التخدير الكافي ، كما تم قياسه بفقدان منعكس إصبع القدم وتباطؤ التنفس ، سيتم تجهيز الفأر للجراحة.
   5. تطهير جلد المنطقة بالبيتادين باستخدام شاش معقم ونظفه بنسبة 70٪ من الإيثانول. سيتم طلاء المنطقة مرة أخرى بالبيتادين.
   6. اقطع ثقبا بطول 5 مم بمقص تحت الجلد بالقرب من الرقبة. باستخدام 10 جرام بزرعان ، قم بعمل نفق صغير (15 مم) في الاتجاه المنقاري. يتم إدخال الحبيبات ظهريا مع المبزير.
   7. ثم يتم إغلاق الفتحة بمادة لاصقة جراحية. قم بتقريب حواف الجرح يدويا باستخدام ملقط وضربات تنظيف لطيفة لتطبيق طبقة رقيقة من المادة اللاصقة السائلة على حواف الجرح التقريبية. قم بتجميع 3 طبقات رقيقة من المادة اللاصقة لضمان توزيع المادة اللاصقة بالتساوي على الجرح. يجب أن تمتد المادة اللاصقة 1 سم على كل جانب من حواف الجرح المثبتة. يمكن أيضا استخدام الغرز أو المشابك الجراحية لإغلاق الفتحة. ضع الفئران مرة أخرى في القفص ، في وضع فردي ، مع وسادة حرارية للتعافي. استبدل الحبيبات كل 4 أسابيع للحفاظ على مستوى ثابت من التعرض للأندروجين. ستتم إزالة الحبيبات الأصلية وسيتم إدخال حبيبات جديدة كما هو موضح أعلاه, في وضع مماثل.

الكيتامين

(100 مجم / مل)

زيلازين

(100 مجم / مل)

ملح

(0.9٪)

175 ميكرولتر 15 ميكرولتر 810 ميكرولتر الحقن داخل الصفاق لمحلول العمل: 0.1 مل / 20 جرام من وزن الجسم

الجدول 1. كوكتيل كيتامين / زيلازين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td > مسحوق بلوري 5α-DHT سيجما ألدريتش < تي دي >A8380-1G < تي دي > داو كورنينج أنابيب سيلاستيك < تي دي >فيشر ساینتفيك < تي دي >11-189-15 د 0.04 بوصة / 1 مم القطر الداخلي × 0.085 بوصة / 2.15 مم القطر الخارجي < td > سيليكون لاصق طبي العامل الثاني ، InC. < TD > A-100 نظارات واقية ومعاطف مختبر وقفازات وأقنعة < تي دي > < تي دي > < td >3 مل حقنة < تي دي >بيكتون وديكنسون وشركاه (BD) < تي دي >30985 < td > الإبرة المرفقة: 20 جرام < > دينار بحريني < تي دي >305176 < td > المسطرة: أي طول يزيد عن 10 سم بمقياس ملليمتر. < تي دي > < تي دي > < تي دي >زيلازين طبيب بيطري واحد AnnSeA LA ، MWI ، Boise < تي دي >NDC13985-704-10 100 ملغم/مل < td > هيدروكلوريد الكيتامين < تي دي >Hospira، Inc < تي دي > NDC 0409-2051-05 100 ملغم/مل الدبابيس الجراحية < td > نظام AutoClip® ، أداة العلوم الدقيقة < >12020-00 حقنة الأنسولين < > دينار بحريني < >329461 1/2 سم مكعب ، جرعة منخفضة من حقنة الأنسولين U-100 < td > المبزل البحوث المبتكرة الأمريكية < تي دي > MP-182 < td >شفرة الحلاقة < تي دي >فيشر ساینتفيك 12-640 < تي دي > كليدوكس < تي دي >فيشر ساینتفيك NC0089321 < td > الوسادة السفلية الجراحية < تي دي >فيشر ساینتفيك 50587953 56616018 أندوين العلمي محلول مطهر للبيتادين < td >Walgreens < تي دي > < td >3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) < td >3M العلوم. تطبق على الحياة < تي دي >