تحضير العضيات من الأورام: نموذج ورم ثلاثي الأبعاد في المختبر

تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية الموضحة هنا بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في قسم الموارد الحيوانية المختبرية ، مركز روزويل بارك الشامل للسرطان ، بوفالو ، نيويورك.

< فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: يجب أن تكون ذكور الفئران المراد تشريحها لعزل أورام البروستاتا أو البروستاتا لتوليد العضيات قد وصلت على الأقل إلى سن النضج الجنسي - حوالي 8-10 أسابيع من العمر. يمكن أن تختلف الأعمار المحددة للفئران بين الدراسات. تتضمن بعض العوامل التي يجب مراعاتها عند اختيار العمر التغيرات المعتمدة على العمر في مجموعات خلايا البروستاتا ، والتعبير المعتمد على العمر لجينات Cre المعدلة وراثيا محددة مدفوعة بالمحفز ، ومعدل تطور ورم البروستاتا في GEMM معين.

< فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: يوضح الشكل 1 وصفا تصويريا لإجراء توليد عضيات الورم.

1. قم بإعداد الوسائط العضوية للبروستاتا في الفأر وفقا ل Drost et al. مع التعديلات التالية. استخدم الوسط المكيف بدلا من البروتينات المؤتلفة ل Noggin و R-Spondin واستخدم تركيزا نهائيا قدره 1٪ (v / v) ، بدلا من 10٪ ، لكل من الوسط المكيف Noggin و R-Spondin.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: تستخدم خلايا HEK293 المنقولة بثبات باستخدام HA-mouse Noggin-Fc أو HA-mouse Rspo1-Fc لإنتاج وسط مكيف Noggin أو R-Spondin ، على التوالي. كانت خطوط الخلايا هذه هدية من مختبر كالفن كو في جامعة ستانفورد.
2. تحضير محلول الهضم في أنبوب سعة 15 مل عن طريق تخفيف 20 مجم / مل من الكولاجيناز II باستخدام وسائط DMEM / F12 (+++) المتقدمة إلى تركيز نهائي يبلغ 5 مجم / مل. أضف مثبط الصخور Y-27632 إلى محلول الكولاجيناز II بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: نسبة عازلة الهضم إلى الأنسجة هي 1 مل إلى 50 مجم ، والتي نستخدمها وفقا ل Drost et al.

1. في غطاء مزرعة الخلايا ، ضع أنسجة ورم البروستاتا في طبق مزرعة معقم مقاس 10 سم ، وقم بتشريح الأنسجة الميتة والتخلص منها.
2. افرم أنسجة ورم البروستاتا المتبقية إلى مكعبات مقاس 1 مم³ عن طريق إمساك قطع الأنسجة بالملقط المنحني المعقم والقطع بمقص التشريح.
3. ضع قطع الورم المفرومة في أنبوب سعة 15 مل مع المخزن المؤقت للهضم عن طريق غرفها بالجانب المنحني من الملقط. هضم أنسجة الورم عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 1.5 إلى 2 ساعة. تحقق من تقدم الهضم كل 20 دقيقة
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: في هذا الوقت ، أخرج ما لا يقل عن 2 مل من المصفوفة من تخزين -20 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج على الجليد. 1 مل من المصفوفة سوف يستغرق حوالي 3 ساعات حتى تذوب.
4. بعد هضم الأنسجة ، أنبوب الطرد المركزي عند 175 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتشكيل حبيبات خلية.
5. قم بإزالة المادة الطافية ، ونفض الغبار عن الأنبوب لفك حبيبات الخلية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من التربسين الدافئ مسبقا مع مثبط الصخور Y-27632 10 ميكرومتر. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
6. بعد الحضانة، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل 5 مرات باستخدام طرف P1000 قياسي. أعد الأنبوب إلى حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أخرى وكرر الخطوة 2.6.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: في هذا الوقت من الإجراء ، قم بتسخين طبق ثقافة خلايا معقم مكون من 6 آبار عن طريق وضعه في حاضنة 55 درجة مئوية.

1. اغسل الخلايا بإضافة 9 مل من AdDMEM / F12 البارد (+++) وجهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 175 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
2. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية ، وقم بنقر الأنبوب لفك الحبيبات ، واغسل الخلايا مرة أخرى بإضافة 10 مل من AdDMEM / F12 البارد (+++). جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 175 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
3. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية ، ونفض الأنبوب لفك الحبيبات ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من AdDMEM / F12 (+++) ، واحسب عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم وفقا للإجراء القياسي.
4. تتناسب القباب المكونة من سبع إلى ثمانية في بئر واحد من طبق مكون من 6 آبار عندما يتم طلاء العضيات في مصفوفة عبر طريقة قطرية. ما يقرب من 200 ميكرولتر من المصفوفة ستنتج 7-8 قباب. حدد عدد آبار العضيات اللازمة للأغراض التجريبية المستقبلية واحسب حجم المصفوفة المطلوبة. بعد ذلك ، احسب حجم المحلول المحتوي على الخلية المطلوب للحصول على تركيز نهائي يبلغ 1.0 × 10⁶ خلايا / مل من المصفوفة.
5. بعد عد الخلايا ، جهاز الطرد المركزي عند 175 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، ونقر الأنبوب لفك الحبيبات ، وأعد تعليق الخلايا في حجم المصفوفة المحسوبة في الخطوة 3.4.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: تبقى المصفوفة في شكل سائل فقط عند 4 درجات مئوية. احتفظ بأنابيب مخزون المصفوفة ومحاليل خلايا المصفوفة على الجليد في جميع الأوقات.

1. امزج محلول الخلايا المصفوفة مع ماصة P200 لتوزيع الخلايا بالتساوي دون إدخال فقاعات. قم بإزالة طبق الاستزراع المكون من 6 آبار من الحاضنة 55 درجة مئوية.
2. قم بتقطيع 200 ميكرولتر من محلول الخلايا المصفوفة بعناية وقم بإسقاط المحلول بسرعة في بئر لإنشاء قباب.
3. كرر الخطوة 4.2. حتى يتم إنفاق حجم محلول الخلية المصفوفة. اترك القباب تتصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
4. اقلب الطبق المكون من 6 آبار رأسا على عقب وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمواصلة التصلب لمدة 20 دقيقة.
5. بعد الحضانة ، أضف 2 مل من الوسائط العضوية للبروستاتا إلى كل بئر. أضف الأندروجين الاصطناعي R1881 إلى كل بئر للحصول على تركيز نهائي يبلغ 1 نانومتر ومثبط الصخور Y-27632 إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر. امزج جيدا وضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية للزراعة.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب استكمال وسائط الثقافة العضوية بمثبط الصخور Y-27632 10 ميكرومتر لمدة أسبوع واحد فقط بعد توليد العضوية.

الشكل 1: مخطط انسيابي لبروتوكول توليد عضيات ورم البروستاتا. بعد تشريح ورم البروستاتا ، افرم الأنسجة إلى قطع 1 مم. هضم قطع الورم في الكولاجيناز ، وجمع الخلايا ، وهضمها في التربسين للحصول على معلق خلية واحدة. بعد عد الخلايا ، أعد تعليق حجم المصفوفة المطلوبة لتركيز خلية 1.0 × 106 خلية / مل. قباب اللوحة في الطبق باستخدام طريقة قطرة حكيمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.