استهداف الجسيمات النانوية الوظيفية لسرطان المبيض: تقنية لتسهيل امتصاص عامل تباين الجسيمات النانوية المترافق بحمض الفوليك بواسطة خلايا سرطان المبيض

الملخص

المصدر: Lusk ، J. F. et al. الكشف عن سرطان المبيض باستخدام قياس التدفق الخلوي الضوئي الصوتي. J. Vis. Exp. (2020)

< p class = "jove_content" >في هذا الفيديو ، نوضح تقنية لتسهيل استيعاب الجسيمات النانوية لكبريتيد النحاس المغطاة بحمض الفوليك (CuS NPs). تتمتع CuS NPs الوظيفية بحمض الفوليك بالقدرة على استهداف مستقبلات حمض الفوليك التي يتم التعبير عنها بشكل مفرط في العديد من خلايا سرطان المبيض.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تخليق الجسيمات النانوية ووظائفها

< p class = "jove_content" > الحذر: يجب أن يحدث كل التوليف في غطاء دخان كيميائي جيد التهوية.

1. قبل التوليف ، قم بتصفية ما يقرب من 300 مل من الماء منزوع الأيونات (DI) من خلال مرشح معقم 0.2 ميكرومتر.
2. نظف قارورة زجاجية مستديرة القاع سعة 250 مل بمحلول منظف واشطفها بماء DI. أضف 0.0134 جم من CuCl₂ إلى 100 مل من ماء DI لإنشاء محلول 1 ملليمتر.
3. أضف 0.015 جم من حمض الفوليك (FA) إلى محلول CuCl₂ وحركه لمدة ~ 5 دقائق باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي.
4. أضف Na₂S·9H₂O (0.024 جم في 100 ميكرولتر من الماء DI) على مدى 10 ثوان تقريبا إلى خليط التفاعل باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر.
   ملاحظه: عند إضافة Na₂S · 9H₂O ، سيتغير لون المحلول من الأصفر الفاتح إلى البني الداكن.
5. قم بتغطية التفاعل وضعه في حمام زيت ، واضبطه على 90 درجة مئوية ، واستمر في التقليب باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي. بعد حوالي 15 دقيقة ، أو عندما يصل حمام الزيت إلى 85-90 درجة مئوية ، اسمح للتفاعل بالاستمرار لمدة ساعة إضافية. يجب أن يتحول الخليط تدريجيا إلى اللون الأخضر الداكن.
   ملاحظه: تأكد من تنفيس النظام أثناء تسخين خليط التفاعل لتجنب تراكم الضغط.
6. قم بإزالة وعاء التفاعل من حمام الزيت واتركه يبرد لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة تقريبا قبل نقله إلى حمام جليدي.
7. بمجرد أن يبرد خليط التفاعل إلى أقل من 20 درجة مئوية ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 10 باستخدام 1M هيدروكسيد الصوديوم لإذابة حمض الفوليك المتبقي في المحلول.
8. قم بتنقية خليط تفاعل FA-CuS باستخدام عمود طرد مركزي 30 كيلو دالتون. أضف المحلول على دفعات 15 مل إلى العمود وجهاز الطرد المركزي عند 3,082 × جم لمدة 15 دقيقة.
9. بمجرد تركيز خليط التفاعل بالكامل ، أعد تجميع الكسور المركزة واغسل 4 مرات ب 15 مل من الأس الهيدروجيني 10 هيدروكسيد الصوديوم في عمود الطرد المركزي 30 كيلو دالتون.
10. لقياسات الكتلة ، خذ 1/3 من المحلول (~ 66 ميكرولتر) وقسمه إلى ثلاث قوارير زجاجية. يجف في فرن مفرغ طوال الليل عند 40 درجة مئوية تحت فراغ ~ 27 مم زئبق.
11. قم بإذابة 2/3 الآخر من المحلول المركز في 250 ميكرولتر من PBS وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.
12. قبل استخدام FA-CuS NPs ، قم بصوتها لمدة 30 دقيقة في جهاز صوتي للحمام على إعداد عال.

< p class = "jove_title" >2. امتصاص خلايا سرطان المبيض FA-CuS NPs

1. قبل الحضانة باستخدام FA-CuS NPs، احتضان خلايا SKOV-3 في قارورة T75 مع 8-15 مل من وسائط RPMI-1640 الخالية من حمض الفوليك مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين لمدة 24 ساعة على الأقل.
2. قم بزرع الخلايا في 0.5 مل من وسائط النمو الكاملة RPMI-1640 الخالية من حمض الفوليك بكثافة 0.1 × 10⁶ خلايا / مل في صفيحة 24 بئرا.
3. في اليوم التالي ، احتضان الخلايا ب 400 ميكروغرام / مل FA-CuS NPS في 0.5 مل من وسائط النمو الكاملة RPMI-1640 الخالية من حمض الفوليك لمدة ساعتين.
4. بعد هذا الحضانة ، قم بتربسين الخلايا ب 0.5 مل من 0.25٪ تريبسين مع EDTA. أضف ما لا يقل عن 1 مل من وسائط النمو الكاملة الخالية من حمض الفوليك RPMI-1640 لتحييد التربسين ، وقم بطرد الخلايا عند 123 × جم لمدة 6 دقائق.
5. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من PBS ، وجهاز الطرد المركزي عند 123 × جم لمدة 6 دقائق. قم بتنفيذ خطوة الغسيل هذه 2x لإزالة أي NPs غير مرتبطة.
6. أعد تعليق الخلايا في 1-2 مل من PBS بمحلول توين 2٪.
7. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم و Trypan Blue. علاوة على ذلك ، قم بتخفيف الخلايا إذا كان عدد الخلايا مرتفعا جدا. تمييع الخلايا في PBS مع 2٪ توين إلى التركيز المختار للكشف.
8. الخلايا جاهزة الآن للتحليل بواسطة نظام PAFC.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.025٪ تريبسين مع EDTA كورنينج 25-053-سيلتر مرشحات الطرد المركزي Amicon Ultra-15 ميليبور UFC903024 مرشحات الطرد المركزي Amicon Ultra-4 ميليبور UFC803024 مقياس الدم ذو الخط الساطع هوسر العلمية 1492 كلوريد النحاس (II) أكروس أورجانكس 206532500 CPX سلسلة حمام التنظيف بالموجات فوق الصوتية الرقمية فيشربراند نموذج CPX3800 محاقن Norm-Ject 10 مل هينكيه ساس وولف 4100-X00V0 FBS سيجما ألدريتش F2442-500 مل حمض الفوليك سيجما ألدريتش F7876-10G برنامج تلفزيوني ألفا إيسار J62036 البنسلين ستربتومايسين جيبكو 15140-122 RPMI Midum 1640 (1x) خالي من حمض الفوليك جيبكو 27016-021 خلايا SKOV-3 ATCC إتش تي بي-77 حبات هيدروكسيد الصوديوم BDH BDH9292-500 جرام كبريتيد الصوديوم Nonahydrate سيجما ألدريتش 431648-50 جرام محلول تريبان الأزرق 0.4٪ أمريسكو K940-100 مل 0.2 ميكرومتر مرشح حقنة معقمة VWR هاتف: 28145-477 الكونوكس سيجما ألدريتش 242985-1.8 كجم المنظفات المستخدمة لتنظيف الأواني الزجاجية. توين 20 سيجما ألدريتش P7949-100 مل